课件：细菌类生物农药.pptVIP

第二讲 细菌类生物农药,2019,-,1,一、细菌与昆虫的细菌性病害 细菌属原核生物界细菌门 原核生物的特点： 1. 拟核由双链DNA构成，也是基因载体，染色体没有结合蛋白。 2. 没有复杂折叠、分割成不同原生质单元的膜系统 3. 70S的核蛋白体分布于细胞之中，,2019,-,2,原核与真核细胞的区别,2019,-,3,附：古细菌（archaebacteria）,具有原核生物的某些特征，无核膜及内膜系统； 也有真核生物的特征，甲硫氨酸起始蛋白质的合成、核糖体对氯霉素不敏感、RNA聚合酶和真核细胞的相似、DNA具有内含子并结合组蛋白。 此外，细胞膜中的脂类是不可皂化的，细胞壁不含肽聚糖。 生活在极端环境中，如：产甲烷菌、极端嗜盐菌、嗜热嗜酸菌。,2019,-,4,二、细菌性感染昆虫后的症状 特点：昆虫活动力降低、食欲减退、口腔和肛门周围有排泄物 病原侵入后导致败血症；虫体死亡后，颜色加深，迅速变为褐色或黑色，部分虫体软化腐烂。 死后虫体一般都有臭味,2019,-,5,2、细菌类生物农药的类群 目前报道的细菌有100种，主要分布在 芽孢杆菌科（Bacillaceae）芽孢杆菌属（Bacillus）、梭状芽孢杆菌属（Clostidium）； 肠杆菌科（Enterobacteriaceae） 沙雷氏菌属（Serratia）、变形杆菌属（Proteus）、肠杆菌属（Enterobacter）， 弧菌科（Vibrionaceae） 气单胞菌属（Areomonas）； 假单胞菌科（Pseudomonadaceae）假单胞菌属（Pseudomonas）,2019,-,6,链球菌科（Streptococcaceae）链球菌属（Streptococus）微球菌属（Micrococus） 立克次氏体（Rickettisaceae） 沃尔巴立克次氏体属（Woerbachia） 立克次氏小体属（Rickettisella） 枝（支）原体目（Mycoplasmatales） 螺属支原体（Spiroplasma）,2019,-,7,3 杀虫细菌报道的种类 芽孢杆菌属： (1)苏云金杆菌（B. thuringiensis） 1901日本石渡首次分离，定义为猝倒杆菌， 1911年Beliner从德国的苏云金地区的地中海粉斑螟中分离得到产伴胞晶体的芽孢杆菌。 1938年第一个生物农药制剂 1953年人们认识到伴胞晶体的功能，之后是毒素,2019,-,8,2019,-,9,2019,-,10,(2) 苏云金杆菌的分类 根据鞭毛抗原(H)，整体抗原（O抗原），将苏云金杆菌分为70个血清型，80个变种,有些菌如140，CT-43等无鞭毛，故无H抗原，则用O抗原鉴定。新H型培养体邮寄到Bt国际咨询中心H.de Barjac博士(法国)，由她建议新H型编号。她自1961年即为巴斯德研究所昆虫病原细菌领导人，该中心亦是WHO昆虫病原细菌参考中心，目前保存有3500株芽孢杆菌，由于在Bt血清鉴定及Bti分离鉴定等方面作出突出贡献，,我国分离了近26个亚种，近20个血清型,2019,-,11,命名 苏云金芽胞杆菌新亚种的命名主要是根据以下四条: (1) 采集地: 如苏云金亚种、肯尼亚亚种、加拿大亚种、以色列亚种、九州亚种、东北亚种(九州和东北为日本省名)、云南亚种、武汉亚种、华中亚种、山东亚种等。 (2) 根据寄主虫名。如蜡螟亚种、玉米螟亚种、松毛虫亚种等。 (3) 根据分离者名字。如Kurstak、Thompson、Morrison等。 (4) 根据病症进行命名。如猝倒亚种、亚毒亚种、杀虫亚种等。,2019,-,12,（2）苏云金杆菌的生长与培养 生长过程：芽孢期、 营养体期（产生外毒素）：24小时形成营养体，46h分裂，68小时进入对数生长期。 孢子囊时期：生长后期开始形成芽孢，并形成与晶体形成有关的蛋白酶,2019,-,13,生长条件： 生长条件要求不高，氨基酸对生长有较大影响， 谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸对生长重要， 缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸对猝倒亚种有生长促进作用 丝氨酸对菌体生长有抑制作用 C、N、P的比例对菌体生长有很大影响 在紫外或阳光下，易失活，,2019,-,14,苏云金杆菌毒素 -外毒素 ：又称卵磷酯酶或磷酸酯酶C，是一种对昆虫肠道有破坏作用的酶。 -外毒素 ：又称热稳定外毒素，耐热毒素 ，它是一种腺嘌呤核苷酸物质， -内毒素 又称晶体毒素。它是一种毒原（protoxin）或称前毒素，须经敏感昆虫肠道蛋白酶消化后，或在碱性条件下由蛋白酶消化或酶解才释放出对昆虫有毒力的较小分子量的毒蛋白。,2019,-,15,（3）杀虫晶体蛋白（ 内毒素） 杀虫晶体蛋白的结构与功能 杀虫晶体蛋白是一种碱性蛋白，每一种杀虫晶体蛋白有其专一性 晶体蛋白可以根据大小分为129-132kD；65-78kD；25-28kD 根据晶体蛋白氨基酸序列的相似性和作用范围分为4种类型， I：鳞翅目；II鳞翅目、双翅目；III 鞘翅目、IV双翅目,2019,-,16,2019,-,17,C端为亲水性端，功能在于维持晶体蛋白的空间构相；含有折叠的二级结构， N端为疏水端，与晶体蛋白肠璧细胞的亲和性有关；含有一个螺旋的二级结构,2019,-,18,一般认为结构域参与孔道的形成 ,结构域决定毒素与受体的特异性结合 ,结构域主要调节毒素的活性。,晶体蛋白一般分为3个结构域,2019,-,19,2019,-,20,回顾,微生物农药的概念 按照功能作用分类 按有效成分分类，各代表种 微生物农药的特点 细菌性农药：苏云金芽孢杆菌,2019,-,21,杀虫晶体蛋白的杀虫机理 一般认为杀虫晶体蛋白杀死昆虫的机理为: 1)晶体在昆虫中肠内的溶解; 2)中肠蛋白酶的降解; 3)中肠膜受体与毒蛋白的结合; 4)毒蛋白插入中肠细胞表层形成离子通道,使敏感细胞的渗透平衡破坏,导致肠体自溶。,2019,-,22,作用过程： 晶体蛋白一般以毒蛋白源的形式存在，在碱性蛋白酶或糜（胰）蛋白酶的作用下，分解为60-80kD的蛋白，改变为具有杀虫活性的毒蛋白。,2019,-,23,2019,-,24,2019,-,25,-内毒素对昆虫的毒害主要是胃肠毒作用，因此，必须由敏感昆虫吞食苏云金芽孢杆菌的-内毒素和芽孢后才能生效。 它们感染的主要途径是：从口腔经食道、嗉囊而至中肠；破坏中肠后，细菌侵入体腔，使血液PH发生变化；菌体进一步繁殖后就引起幼虫败血症及全身瘫痪而致死亡。,2019,-,26,-外毒素的毒效比-内毒素要低，而且它的作用仅在昆虫脱皮或变态时可以明显看到，这种毒素可杀死多种昆虫的幼虫或使幼虫发育不正常，虫体某些部分残缺不全等。 例如，家蝇3龄幼虫对这种毒素非常敏感，感染3天后可引起幼虫脱皮时死亡或造成独特的致病症状，使幼虫发育受到明显的影响，如出现半化蛹（上部是幼虫，下部是蛹）、畸形蛹、不羽化蛹，以及形成畸形的成虫，包括残缺翅、窄而光的腹部、上唇萎缩等现象。,2019,-,27,毒蛋白的基因的克隆与利用,1991年,Carrize等首次将技术用于杀虫晶体蛋白基因的鉴定和杀虫活性的预测，根据当时已公布的基因序列设计了12条特异引物,并根据鉴定的基因对菌株的杀虫活性进行预测,预测的结果与实际生测的结果相同。 1993年,浅野真一郎根据cry基因的保守区序列设计了寡核苷酸引物,扩增后,用限制酶消化,根据酶切片段的长度差异即可鉴定cryIIA，cryIIB基因，,2019,-,28,1993，Brousseau和Bourque 在总结前人基础上创建了RAPD-方法, 1996年, Kou分别建立了PCRRFLP和复合引物的鉴定方法。 1997年,宋福平也通过此方法进行了一些研究工作； 截止2001年5月,全世界已经发现200多种杀虫晶体蛋白基因,2019,-,29,该技术由Grodzicker等于1974年创立。特定生物类型的基因组DNA经某一种限制性内切酶完全酶解后，会产生分子量不同的同源等位片段，或称限制性等位片段。RFLP标记技术的基本原理就是通过电泳的方法分离和检测这些片段。凡是可以引起酶解位点变异的突变，如点突变（新产生和去除酶切位点）和一段DNA的重新组织（如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化）等均可导致限制性等位片段的变化，从而产生RFLP。,Restriction fragment length polymorphism,补充1：,2019,-,30,RAPD (random amplified polymorphic DNA ) 由Williams等于1990年创立。其基本原理与PCR技术一致。 PCR(Polymerase chain reaction )技术是一种体外快速扩增特异基因或DNA序列的方法，由Mullis等于1985年首创。,补充2：,2019,-,31,苏云金杆菌其他杀虫蛋白 迄今,苏云金芽胞杆菌已发现有十几种生物活性成分 ，如辅助蛋白可以有利于提高晶体蛋白的杀虫活性。 如双效菌素(zwitternicinA)除具有增效苏云金芽胞杆菌的杀虫活性外,还具有抑制疫霉和腐霉的生长作用,可用于防治植物病原菌病害的目的 存在于苏云金芽胞杆菌细胞内的自身诱导物抑制蛋白(autoinducerinhibitor ）可以抑制植物病原菌细胞间信息传递的关键分子 ，达到降低病原菌毒素基因表达的水平,避免植物致病的产生,几丁质酶,2019,-,32,VIP蛋白（(vegetative insecticidial protein） 营养期杀虫蛋白已被视为苏云金芽胞杆菌的第二代杀虫蛋白.但目前对营养期杀虫蛋白的了解还远不及杀虫晶体蛋白。 蛋白的杀虫活性高Vip3A对小地老虎毒杀力比cry1A高260倍，对具有（杀虫晶体蛋白）抗性的昆虫有很好的疗效。,2019,-,33,杀虫基因的应用 1 多基因复合杀虫蛋白基因工程菌的构建 2 转基因植物的构建,2019,-,34,苏云金杆菌发酵工艺 1. 发酵工艺一般流程 原料 灭菌 微生物培养浓缩晶体蛋白的分离活性测定 菌种 2.发酵培养基： 豆饼粉2.5, 淀粉2.0, 酵母粉2.0, 玉米浆2.0, 添加剂号0.1, 葡萄糖1.0, KH2PO40.3, CaCO30.1, CaCl20.05, MgCl20.01, CuCl20.005, ZnSO40.002, CoCO30.005,2019,-,35,3. 培养条件 温度：28-30，通气量：1:0.511,2019,-,36,固体发酵工艺,2019,-,37,2019,-,38,苏云金芽孢杆菌制剂 剂型：粉剂，悬浮剂 生产厂家：武汉科诺，扬州绿源，重庆聚立信生物工程有限公司 （3000t）山西 益尔生物制品有限公司（600t）山东龙口格林生物制品有限 公司 标准： 1964年：在伦敦召开的苏云金杆菌的分析与鉴定会议提出Lc50和标准品的使用 1966年：在荷兰，巴斯德研究院用E-61为标准制剂，效价标准为1000IU/mg,2019,-,39,我国Bt杀虫剂的质量检测技术已基本与国际接轨，现已分别建立了以棉铃虫为试虫和以小菜蛾为试虫的生物测定方法，重现性都很好，变异系数小于20%。1995年6月，我国农业部农药检定所以生物测定为基础下达了我国Bt杀虫剂的部颁标准。,2019,-,40,质量标准 测定死亡率：计算校正死亡率(T-C/1-C)100% 转换成Lc50 转换为效价：样品效价pS/Y P:标准品效价 S: 标准品Lc50 Y:样品Lc50,2019,-,41,球形芽孢杆菌（B. sephaericus）（防治双翅目昆虫） 日本金龟子芽孢杆菌（B. popilliae）（鞘翅目昆虫） 缓病芽孢杆菌杆菌（B. lentimorbus）（鞘翅，无伴胞晶体） 蜡状芽孢杆菌（B. cereus）（鞘、膜、鳞30多种昆虫，a毒素） 森田芽孢杆菌（B. moritai）（双翅目，使幼虫致死、成虫畸形） 蜂房芽孢杆菌（B. alvei）（膜翅目、引起欧洲蜜蜂的腐臭病） 幼虫芽孢杆菌（B. larvae） 嗜虫黏质芽孢杆菌，鳞翅目幼虫有极强的毒力,其他杀虫芽孢杆菌,粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）1886年从病蚕体中分离得到，对鳞翅目、叶蝉、飞虱有致病作用，效果不稳定。,2019,-,42,细菌杀菌剂,革兰氏阴性菌和阳性菌两类。 革兰氏阴性菌：假单胞菌和放射性土壤杆菌 革兰氏阳性菌：芽孢杆菌,2019,-,43,假单胞菌：如绿脓杆菌、荧光假单胞菌、败血假单胞菌、微球菌 抗病机理：抑制和抗菌作用,2019,-,44,枯草杆菌（Bacillus subtilis）生物农药 代谢产物 枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质 作为杀菌剂，对多种植物病原真菌如多种灰霉病菌、白粉病菌、立枯病菌、枯萎病菌等有很强的抑制作用，能有效提高作物产量，改善作物品质. 作为饲料添加剂，随同饲料一起进入机体内发生作用，促进饲料的分解利用，并具有拮抗肠道病原细菌，维护和调节肠道微生态平衡的作用,2019,-,45,具体包括： （1）改善体内生存环境，减少氨，胺，硫化氢等有害物质的产生；微生态制剂能分解饲料消化过程产生的氨，胺，硫化氢等有害物质，降低体内及体外有毒物质含量，此作用在水产动物中尤其重要； （2）增强动物体免疫功能，抵御感染；有益微生物细胞壁含有的免疫多糖l类物质，可以增强动物的免疫能力，激活巨噬细胞吞噬病菌的能力；,2019,-,46,（3）促进动物生理机能成熟；绒毛加长，粘膜陷窝加深，从而使小肠吸收面积增大 （4）产生多种酶类，芽孢杆菌能产生丰富的淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶及纤维素酶等，提高消化酶活性，促时动物对营养物的消化吸收。增进健康、促进生长，维持养殖生态平衡，高效分解老化塘底的淤泥，保持 pH稳定，净化底质。适于在鱼、虾、鳗、龟、鳖、蟹、蛙、鳝、螺、蚌、泥鳅及特种水产等养殖业中使用。使用本产品不仅能取得较好的经济效益，而且还具有极好的生态效益。,2019,-,47,立克次氏体 立克次氏体比细菌小，介于病毒与细菌之间，0.30.6m0.82.0m 可以通过细菌过滤器。（也有认为不能透过） 有细胞璧，如G细菌 对部分抗生素敏感如磺胺， 营细胞内寄生生物，存在于细胞质内 立克次氏体在虱等节肢动物的