课件：演示文稿9.ppt

主要内容,一、细菌生物被膜的结构特点 二、细菌生物被膜的形成机制 三、细菌生物被膜抗药性机制 四、细菌生物被膜的研究技术 五、细菌生物被膜的相关治疗方法,2019,-,一、细菌生物被膜的结构特点,生物被膜（biofilm）：指细菌自身产生的外部多糖基质、纤维蛋白质、脂蛋白等包裹着的菌细胞的结构。,结构： 由外到内依次为： 生物被膜层（bulk of biofilm） 连接层（linking film） 条件层（conditioning film） 基质层（substratum),2019,-,化学组成 水分（97%）是生物膜的生命线！ 胞外多糖（EPS） 吸附的营养物质及代谢产物、细菌裂解物 蛋白质、DNA、RNA,2019,-,生物被膜内部细胞获得营养的途径：,一、位于生物被膜中心或底部的细胞处于静止状态，减少对营养物的需求； 二、生物被膜中保持水流通道，增加生物被膜的表面积和对流转运能力； 三、菌体从生物被膜上脱落，释放出小块生物被膜和单个细胞，从而获得更多的营养。,2019,-,二、细菌生物被膜的形成机制,1.生物被膜的形成过程 2.生物被膜形成的相关基因 3.生物被膜的调控机制,2019,-,1.生物被膜的形成过程,（1）粘附（adherence） ：当无菌的医用植入器材( 多为生物材料多聚物) 植入体内之后， 其表面立即被唾液、血液、尿液及胃肠道内黏液等各种体液包围，各种糖蛋白、粘多糖、金属离子和其它成分会在数分钟内渗透并吸附到其表面， 形成条件膜。条件膜象网一样覆盖基质表面， 使细菌到达时能够 看见膜的成分， 并进一步吸附其上。钠、镁等阳性金属离子便常常作为带负电的细菌和带负电的物体表面( 自然界多数表面都带负电) 连接的桥梁。,2019,-,细菌有多种粘附表面的策略：,1.细菌外膜蛋白与特定材料表面的结合具有高度亲和性。 这种策略的局限性在于细菌必须和表面之间的距离足够近, 才能使外膜蛋白起到粘附作用。,2.利用游离细菌产生的粘性长链胞外多糖协助起始吸附。 虽然这种粘附作用的特异性较低, 但是利用多糖的长度优势, 可以克服细菌与疏水表面之间的静电排斥力, 细菌分泌的多糖通常具有多种化学官能团, 能够与疏水表面之间产生共价键、氢键、疏水作用力和静电引力以促进吸附。,3.运动细菌还具有其它的吸附策略, 鞭毛和IV 型菌毛等都具有粘性末端, 它们也可以与胞外多糖一起完成细胞和疏水表面的粘附。,2019,-,（2）增值（accumulation）,已黏附的细菌通过分裂，使生物膜增厚，并分泌细胞外基质，将细菌包裹在内，同时形成通道与空隙供细菌进行物质代谢与信息交流。参与此过程的细菌表面物质主要有胞外多糖,蛋白质，磷壁酸和细胞溶解所产生的细胞外DNA等。 细菌为适应自然环境而产生的变化：增加对紫外线的抗性、遗传交换效率、降解大分子物质的能力以及增加二级代谢产物的产率等。也正是BF 细菌的这些特性导致了严重的临床问题。,2019,-,（3）成熟（maturation）,成熟的BF 形成高度有组织的结构，利用激光共聚焦显微镜观察到成熟BF 结构是不均匀的，即具有不均质性，它是由类似蘑菇形状的微菌落组成的，在这些微菌落之间围绕着输水通道，可以运送养料、酶、代谢产物和排出废物等。因此，有人将成熟的BF 内部结构比喻为原始的循环系统。当细菌在增殖时可因菌种、营养、附着的表面和环境条件不同，形成疏松或致密以及厚薄不等的BF 结构。,2019,-,在BF 成熟过程中，细菌的密度感应系统起着非常重要的作用。,例如，铜绿假单胞菌的密度感应系统突变株，与野生菌株相比，其形成的BF 较薄，缺少复杂的结构，且抗性较差。,革兰阴性细菌的密度感应系统大多是利用N2酰基高丝氨酸内酯(N2acyl homoserine lactones , AHL) 作为信号分子，AHL 浓度随细菌密度的增加而上升，当AHL 达到一个阈值时，可与一种转录激活子结合而激活，AHL和转录激活子复合物进一步诱导靶基因的表达。,2019,-,细菌密度感应系统是细菌通过监测其群体的细胞密度来调节其特定的基因表达，以保证BF 中营养物质的运输和废物的排出，避免细菌过度生长而造成空间和营养物质的缺乏。 研究发现与细菌生物膜形成有关的密度感应系统主要有以下三类: (1)酰基高丝氨酸环内酯(AHL)密度感应系统: 存在于革兰氏阴性菌中，其自诱导物为AHL类分子。LuxI蛋白是AHL合成酶，脂肪酸在LuxI蛋白作用下合成为AHL-LuxR是AHL的受体,是一种转录调节蛋白。AHL可以自由通过细菌胞膜，当细菌周围环境中AHL的浓度达到一定阈值后，就会激活细菌内的LuxR蛋白,形成AHL-LuxR复合物，通过细菌内的生化反应作用于目的基因，启动目的基因的转录。,2019,-,( 2 )自诱导肽( autoinducingpeptides,AIPs)密度感应系统: 存在于革兰氏阳性菌中,其自诱导物是AIPs,是细菌合成的氨基酸或寡肽。细菌分泌到胞外的AIPs浓度随细菌密度的增加而升高,当AIPs的浓度达到一定阈值时,就会激活细胞膜上的受体组氨酸蛋白激酶,使之自动磷酸化,组氨酸蛋白激酶再磷酸化反应调控蛋白,磷酸化后的反应调控蛋白再作用于目的基因,引起包括AIPs合成在内的目的基因转录和翻译。,2019,-,(3)自诱导物-2(AI-2)密度感应系统： 广泛分布在革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中。AI-2是此类密度感应系统中细菌分泌的自诱导物，是呋喃酮衍生物。细菌合成AI-2并分泌到细胞外，随细菌密度的增加，细菌外AI-2的浓度增加，当AI-2的浓度达到一定阈值后，与外周胞质中的luxP蛋白结合，AI-2/luxP 复合物与细菌胞膜上的组氨酸蛋白激酶结合，启动类似AIPs的多级磷酸化生化过程，引起目的基因的表达。对每种密度感应系统，不同细菌分泌的自诱导物在分子结构上不完全一致。,2019,-,（4）播散（detachment）,为了维持生物膜的功能性和稳定性，成熟的生物膜达到一定程度后，调控细菌数量的机制开始发挥作用，使单个细胞或生物膜的某个完整的部分脱落，并随血流等转移到其他器官，形成新的病灶。,目前有学者认为，关于生物被膜内细菌脱落机制可能有三种方式： （1）游群扩散； （2）聚丛扩散； （3）表面扩散,细菌生物被膜碎片移植到新的表面，如同生物被膜有一种内在的信号引起浮游细胞从生物被膜中释放。生物被膜本身可能并不具有致病性，但膜内细菌脱落后可在新的部位定植形成新菌落而导致感染的扩散或复发。,2019,-,2019,-,2.生物被膜形成的相关基因,2019,-,icaD,用刚果红法检测62株表皮葡萄球菌中产黏质物菌株有26株，产黏质物菌株中icaA（22）、icaD（19)、icaA 和icaD（17），阴性（2）基因表达阳性的菌株。,icaA和icaD,表皮葡萄球菌icaA和icaD基因表达及其与黏质物形成的关系,2019,-,临床分离金黄色葡萄球菌生物膜相关基因的PCR分析,方法：96孔板番红染色法检测生物膜的形成，icaAD、icaBC、sar、agr和sigB的PCR扩增，并对产物进行测序和同源性比较。 结果： 27株金黄色葡萄球菌中共有17株形成了肉眼可见的生物膜，其中以X387和X409两株最明显；有22株扩增出icaAD和icaBC，全部菌株扩增出sar、agr和sigB。 结论： ica是形成金葡菌生物膜的关键基因，但ica在形成生物膜过程中需要其他基因的协同作用。,2019,-,3.生物被膜的调控机制,细菌建立感染必须激发大量毒力分子的共同表达。毒力因子之间精细的合作与调节是病原菌存活和成功侵入寄主的关键。同样，细菌从游离状态到聚集形成成熟的生物膜过程中， 也牵涉到复杂的调控机制， 主要是由环境信号应答系统和群体感应系统来完成的。 不利的环境因子对细胞产生刺激，激活了细胞的环境信号应答系统，使细胞内的调控元件的转录或表达发生改变，进而影响胞外多糖、鞭毛、菌毛以及淀粉样蛋白纤维组成蛋白的合成，改变细胞表面的结构， 使之向固体表面粘附。,2019,-,一旦粘附的细胞达到一定的数量, 就会诱发群体感应系统， 使细胞产生并分泌自诱导素A Is，胞内外的自诱导素积累到一定的浓度, 就会超过细胞所能承受的阈值, 这些自诱导素就会结合到细菌的自诱导素应答元件上, 顺序的引起细胞内相应的蛋白转录或表达水平改变, 使细菌在固着表面大量的聚集，进而形成复杂的生物膜系统。,2019,-,三、细菌生物被膜抗药性机制,1、渗透障碍 （1） 生物膜内细菌密度高，细菌之间的空间狭小，并有大量胞外基质包裹， 这样的三维结构形成一道屏障，抗生素在其中的扩散速度减慢， 无法以有效浓度渗透至深部细菌之中，从而使药物难以发挥其杀菌作用。 （2）生物膜负电荷的胞外脂多糖可与大量的抗生素分子结合，使达到细菌部位的药物浓度显著降低； （3）许多抗生素水解酶可以固定在生物膜上，使进入膜内的抗生素被灭活。 越来越多的证据表明，渗透障碍并不能解释生物膜的所有现象。尽管环丙沙星和氨苄西林可以渗透整个缺乏-内酰胺酶的肺炎杆菌生物膜， 细菌仍然对这些药物不敏感。,2019,-,2.营养物质的限制,生物膜内的细菌由于营养供应不足， 处于饥饿状态， 同时还有大量代谢废物堆积， 故生长速度慢。分裂不活跃，使得细菌的代谢率降低，抗生素通过作用于代谢环节去影响细菌活性的概率也降低。 Evans 等人观察到生物膜状态和浮游状态的铜绿假单胞菌对环丙沙星的敏感性均随着其生长速度的升高而升高，但是在精确控制生物膜菌株的生长速度时，处于相同生长速度的生物膜菌株和浮游菌株的耐药性仍然有较大差别， 因此单独用生长速度来解释生物膜细菌耐药性并不能得到圆满的结论。,2019,-,氧气供不足也被认为有助于生物膜耐药性的产生。,Walters 等研究显示环丙沙星和妥布霉素仅在生物膜与空气的界面和氧气浓度高的区域发挥抑菌作用。,Yoon 等研究显示铜绿假单胞菌在厌氧条件下能形成健全的生物膜， 并且其形成需要特定基因表达产物的参与，这提示了氧供不足能引起膜内细菌生理学和表型变化， 从而导致耐药性增加。,2019,-,3、生物膜表型的表达,生物膜表型：即对生长表面的粘附触发了部分细菌亚群基因表达的变化， 使其生物学行为也随之改变。 白色念珠菌拥有的编码外排泵的MDR 基因和耐药性相关基因CDR 基因家族，在生物膜中表达均有增强，可能引起细胞膜上外排泵数目增多或活性增强，导致生物膜中的菌株出现耐药性。而人工敲除细菌中的这些耐药性基因， 所培养的浮游菌 株耐药性下降， 生物膜菌株耐药性却没有明显下降，表明耐药性并不是单一的耐药性基因所控制的。,2019,-,另有研究表明，生物膜中有部分表型变异株在高抗生素浓度下能照常生长。Drenkard 等人发现，铜绿假单胞菌中存在一种调节蛋白(PvrR)， 该蛋白控制铜绿假单胞菌对抗生素敏感和耐药的转化。这种表型变化通常是可逆的， 并且高频率地随机发生，使生物膜具有较高的异质性， 有利于其应对突发的环境变化。 Deziel 等人提出表型变化调控着细菌在生物膜和浮游状态之间的转化，它能保证当条件适宜时， 细菌能重新启动生物膜的形成。 因此，从mRNA水平和蛋白水平探索细菌生物被膜状态和浮游状态中基因表达的差异，是目前生物被膜耐药性研究的一个热点。,2019,-,4、顽固耐药菌(persister),顽固耐药菌也被认为与生物膜的高耐药性有关。 Brooun 等人研究证明一定浓度抗生素能杀死生物膜内大多数细菌, 但即使增加药物浓度, 仍有少部分细菌存活。 Spoering 和Lewis 实验证明处于静止阶段的浮游菌和生物膜内大部分细菌的耐药性相似, 而一小部分顽固耐药菌是生物膜难以清除的主要原因。 Harrison 等也有类似的发现, 生物膜在暴露于阳离子杀菌剂的前2 h4 h 表现出两倍于浮游菌的耐药性, 但两种状态的细菌27 h 后在同一浓度下被杀灭, 他们认为是由于少数顽固耐药菌的存在导致出现该现象。,2019,-,Keren 等人得出它们并没有可遗传的耐药性传给子代， 生物膜破坏后即恢复对抗生素的敏感性。 Lewis 等提出程序化细胞死亡(Programmed CellDeath, PCD)假说, 认为顽固耐药菌可能正是因为存在PCD 程序缺陷，所以在抗生素引起细胞损伤而触发PCD 造成大部分细菌死亡时，顽固菌仍能存活，从而增加了生物膜的耐药性。,目前对顽固耐药菌确切的耐药机制仍不清楚。,2019,-,5、细菌传感效应(Quorum sensing, QS),细菌传感效应被认为在生物膜耐药性上起着重要的作用。传感效应是同种或不同种细菌通过各种信号传导系统对它们当前所处环境、群体密度的感知、交流, 使菌体间相互协调生理活动以趋利避害。,QS现象是于1977年在一种海洋发光细菌中首次发现的，此系统包括自诱导物的产生、释放和检测，通过检测周围细菌的密度，细菌可以通过调整相关基因的表达而实现群体稳定性调节。,细菌传感效应的关键是小分子信号分子的合成和浓度的增加。目前已知有5 类信息激素:AHL (a-cyl homoserine lactones ) 、PQSs ( hep-tyl-hydroxy-quinolones) 、Al-2、循环二肽(cyclic dipeptide) 和寡肽(oligo peptide),2019,-,如：革兰氏阴性细菌QS 调控机制所用的信号分子一般是脂肪类物质，主要是酰基高丝氨酸内酯及其衍生物(AHLs)，信号分子没有种属特异性,却有着相似的调控机制。 革兰氏阳性菌QS 的信号分子一般是寡肽和氨基酸,其调控过程包括寡肽的合成、加工、分泌及其对寡肽的响应等，而且调控过程没有统一的模型。,细菌QS 系统的研究表明，QS 参与很多生物学功能的调控，控制着病原菌的致病性(包括胞外酶的产生、毒性因子的表达等) 和某些细菌生物膜的形成。通过QS 信号系统可以控制并协调整个细菌群体行为，共同对周围环境刺激做出反应，极大增强了整个细菌群体的生存能力。,2019,-,6、普遍应激反应(General stress response),由于生物膜内细菌的耐药性与由生长速度启动的普遍应激反应有关，应激反应导致细菌的生理学改变，使其在各种环境下得到保护。因子rpoS 是一种普遍应激反应的调控因子，能激活一系列基因的转录，使细菌在营养匮乏条件下维持生活力。,Xu 等人报道铜绿假单胞菌生物膜内细菌的 因子rpoS 相对于静止阶段的浮游菌表达水平高, 提示生物膜内的环境如营养缺乏或有毒代谢产物的堆积, 激活了 因子rpoS 的表达, 使细菌发生生理变化以抵抗环境压力和抗生素作用。,然而Whiteley 等人用rpoS突变株形成的生物膜却具有比野生株生物膜更强的对妥布霉素的耐药性, 故rpoS 在生物膜的耐药性中所起的作用还需进一步研究。,2019,-,四、细菌生物被膜的生物膜检测技术,1、菌体计数 即通过计算生物膜中菌体对生物膜进行量化。为了将生物膜与其黏附的固体表面分离,通常使用一些机械方法,比如超声或涡旋,得到的菌液常用平板菌落法,通过计算菌落形成单位(Colony forming units,CFU)对生物膜内的活菌计数。另外,生物膜中包括死菌的总菌体数也可以通过显微镜直接计数。,2019,-,2.染色法 利用生物膜内物质对某些染料的结合,可以通过染色的办法对生物膜进行定量。最常用的就是结晶紫,先将1%的结晶紫溶液浸润生物膜生成的表面,静置30min后用水洗去未结合的染料,将剩余的水除去后,用乙醇或乙酸溶液溶解附着于生物膜上的染料,所得有色溶液用分光光度计或酶标仪测定590纳米处吸光值。该方法简便快捷,适用于试管及96孔板法造膜。,2019,-,3.荧光法 荧光染料的应用使生物膜的观察有了选择性。用Syto9及碘化丙锭(Propidium iodide,PI)显示不同颜色的荧光可以区分生物膜中的死活菌,这对于生物膜的清除研究意义重大。 另外用荧光标记的抗体或凝集素，更可以特异性地识别生物膜中的某些成分而显色,进一步而言，荧光原位杂交(Fluorescent in situ hydridization,FISH)的应用使我们对生物膜内的物质分布有所解。除了外加荧光染料外，绿色或红色荧光蛋白，不论是质粒介导的还是重组入基因组的，都已成为生物膜检测领域中广泛运用的分子生物学工具。,2019,-,4.激光共聚焦显微镜(Confocal laser scanning microscope,CLSM) 普通荧光显微镜下，许多来自焦平面以外的光使观察到的反差和分辨力降低。而激光共聚焦显微镜则通过检测器前的小孔保证只有来自焦平面的光成像，其他散射光被挡住，从而使显微镜的分辨力得以提高。 由于激光共聚焦显微镜可对较厚的样品进行无损伤“光学切片”，再通过三维重构得到样品的立体结构， 即生物膜的三维立体图像。,2019,-,2019,-,2019,-,5.电子显微镜 电子显微镜是用电子束和电子透镜代替光束和光学透 镜,使物质的细微结构在非常高的放大倍数下成像的仪器, 其分辨力可达纳米级甚至更小。按照工作方式的不同分为 透射电子显微镜(Transmission electron microscope,TEM)和扫描 电子显微镜(Scanning electron microscope,STM)。透射电子显 微镜是把经加速和聚集的电子束投射到非常薄的样品上,电 子与样品中的原子碰撞而改变方向,从而记录产生的立体角 散射成像。,2019,-,缺点： （1）电子显微镜需在真空条件下工作,所以很难观察活的生物，而且电子束的照射也会使生物样品受到辐照损伤。 （2）电子束在有结合水存在的真空条件下无法工作,但生物膜中95%的成分都是水,所以脱水的过程对样品的影响很大。 （3）昂贵的设备,相对繁琐的样品制备工作也使电子显微镜在生物膜研究领域的应用受到限制。,2019,-,6.原子力显微镜(Atomic force microscopy ,AFM) 原子力显微镜通过检测待测样品表面和一个微型力敏感元件之间的极微弱的原子间相互作用力来研究物质的表面结构及性质。将一对微弱力极端敏感的微悬臂一端固定,另一端的微小针尖接近样品,这时它将与其相互作用,作用力将使得微悬臂发生形变或运动状态发生变化。 扫描样品时,利用传感器检测这些变化, 就可获得作用力分布信息,从而以纳米级分 辨率获得表面结构信息。该技术诞生于 1985年,近年来应用范围不断扩展,目前在 生物膜研究领域也有所建树。,2019,-,五、细菌生物被膜的治疗,1.抗菌药物,2019,-,2.抗感染微生