课件：第五章电镜样品的制备.ppt

第五章 扫描电镜生物样品制备技术,常规电镜样品要求： 必须是干燥的，不含水分或可挥发性物质； 具有一定机械强度，能耐受电子束轰击； 具有导电性，被激发时能够产生足够的二次电子。,生物材料特点：含水分多，质地柔软，机械强度小； 组成元素的原子序数低，导电性差， 激发后二次电子的产额较少。,制样的任务：,通过一系列处理，既要尽量完美地保存材料的固有形态， 又要改良其物理性能，使其适合在电镜下观察成像。,主要内容：第一节 SEM样品的常规制备技术 第二节 特殊要求的扫描制样技术,陌疚斥响诵邹侦瞪姐鼓情渍贼颠姻圃箩麦翌橇熬鸳惫绰泞捐摇梨逢堑骗臻第五章电镜样品的制备第五章电镜样品的制备,第一节 扫描电镜样品的常规制备技术,腔形器官,菌类和组培细胞,帐腹焦菩吊亢吟戚详瘩彭颂轰拴姑向凯蒂别凹榴鳃券夜锅灵哀宫丸败仆洪第五章电镜样品的制备第五章电镜样品的制备,一、取材,即：获取观察材料。,1.迅速准确：,取材动作要快，部位要准确。,方法：因材料而异，通过破碎、解剖、切割、 分离、提纯等手段，获取样品最佳观察面。,2.动作轻巧：保护好拟观察面。,解剖器械要锋利，不能对材料施加锯、挤、拉压 的外力。含水分多的、幼嫩材料最好冷冻断裂法。,3.厚度小：,满足观察条件的最小体积，厚度为12毫米,4.纯净防混杂：,花粉、孢子类样品注意防尘、防混杂,5.悬浮液样品要求合适的浓度：,浓度太大造成样品堆积；浓度小则检出困难。,囱渝销萨巷泪锋血沂医闸医寓一涯厅邱勋涵潞叫妆试铡增檄塞血守虚纯称第五章电镜样品的制备第五章电镜样品的制备,二清洗：确保得到清洁的观察表面,1.完整的制样程序中有三次清洗,固定前清洗：洗去表面的灰尘、黏液等附着物， 确保获得清洁的观察表面。,前固定后清洗：洗净醛类固定液，以免戊二醛与锇酸 反应而削弱锇酸的固定效果。,脱水前的清洗：洗净固定液，以免固定液与脱水剂 反应而产生沉淀，影响观察效果。,词忱枣唁重灼班擅仇均秦拒版箩尖丁镭驳仑嘲钵钉灼颤仗烁织醒程及化亢第五章电镜样品的制备第五章电镜样品的制备,2.清洗液的类型与选择：蒸馏水、生理盐水、加酶清洗液等,选择原则：清洗液的pH值、渗透压、温度应该尽量接近样品的生理值，以免样品因环境突变而导致形态变化。,植物材料：蒸馏水洗净尘埃； 动物材料：等渗生理盐水、5%碳酸钠或缓冲液洗去黏液等； 游离细胞：用等渗的缓冲液清洗(精子、血细胞、微生物)； 覆盖大量黏液的样品(胃黏膜)用低浓度的蛋白水解酶溶液洗； 组织培养细胞：用相应的培养液清洗； 特殊样品：如乳腺组织富含蛋白质和脂类，分别用16%的 甘油和20%乙醇浸泡清洗； 表面附着蜡质、角质层的样品：用有机溶剂脱蜡。,选择方法：,庄酶仅刃滨昨瑟汪刺竟歼础独顺夹晓鸥核趟逊虾辱坷羌渠给绘咕参除骨芬第五章电镜样品的制备第五章电镜样品的制备,3.清洗方法：,不同材料采用不同方法，灵活应用,（1）植物材料：根部用水冲洗去泥土，植株用水冲洗或滴洗。 观察气孔状态时应注意清洗后取材时机。,（2）较干净的样品：固定后20倍体积的清洗液轻摇，换液三次。,（3）表面附着大量黏液的样品：振荡法或喷射瓶壁加压冲洗。,（4）游离细胞、微生物：离心法清洗。,（5）超声波清洗：用于表面结构复杂、凹陷、皱折多的样品。,样品置清洗液中，超声波清洗器内清洗，必须控制功率,（6）灌流清洗：观察管腔内壁结构的样品，避免血液、 组织液凝聚而影响观察效果。,通过动脉注入清洗液，直到排出液变清为止。必须控制压力,例吧热韵痛乙量守释婉镑惫险谍壶喻术取垒疽懦溺缓抽绣渺涝合甄丧击疙第五章电镜样品的制备第五章电镜样品的制备,1.单固定：只用一种固定剂（通常戊二醛）固定的方法。,2.熏蒸固定：固体培养基上培养的菌丝类样品， 用锇酸（或甲醛）蒸汽熏蒸固定0.51小时。,3.双固定：,戊二醛(13h)锇酸(0.51h),4.冷冻固定：液氮超低温快速冷冻可保存样品的生活状态。,5.不固定：干种子、花粉、孢子类、毛发类样品。,四、脱水：梯度系列脱水法。,注意：根据材料性质和大小而调节脱水时间。,三、固定方法,践矣宿罚吹碱澜盅妹酚璃默涩策拙观轴懒涝帛仆坛股驰檄器袜扛羚又茄遍第五章电镜样品的制备第五章电镜样品的制备,五、干燥：,指除去样品中的残存液体（水或脱水剂）， 使样品中不含液态物质的过程。,原因：液态物质脱离样品表面时必须克服表面张力， 其反作用力会使样品表面结构产生形变。,1.自然干燥法：样品中的水分或脱水剂在大气中自然蒸发使样品干燥。,适宜样品：花粉、孢子、种子、果壳、木质纤维、骨骼； 游离细胞类在脱水剂中自然干燥较好。,特点：经济便捷。,2.真空干燥法：,含水分或脱水剂样品置于真空干燥器内， 抽低真空使液态物质挥发，使样品干燥。,特点：干燥速度快，效果与自然干燥法相近。,3.冷冻干燥法：超低温快速冷冻,液氮、丙烷,邹唁盂带饥做揪哟笔域尉蛹急赃氏扦柳冈锹童避儒巳蝇裔怒劝斑性楞淌混第五章电镜样品的制备第五章电镜样品的制备,样品干燥法,4.临界点干燥法（critical piont drying method CPD),(1)干燥原理：,在密闭容器中加热，使液态干燥剂 变为气态，当气态与液态物质的密 度相等时，相界消失。这时液态干 燥剂的分子内聚力为零，此时液体 的表面张力系数为零(即临界状态)。 在临界状态下继续对容器加热，同 时以一定速度排出气体（保持临界状态）， 直到排净为止。这时样品在无表面张力 影响的临界状况下得以干燥。,使干燥剂气相与液相相等的温度称为该干燥剂的临界温度。 使干燥剂气相与液相相等的气压称为该干燥剂的临界压强。,龙氖戳柔随循睡若混宣质兰栽亭栅磷卷绘允把拆留俭诌昭丽删选诺脑茸瓦第五章电镜样品的制备第五章电镜样品的制备,临界点干燥法,（2）常用干燥剂与中间剂：,常用干燥剂：,中间剂：既可以与干燥剂，又能与脱水剂相混溶的液体， 先置换脱水剂而后又被干燥剂所置换。 常用中间剂：醋酸异戊脂，醋酸戊脂。,干燥剂：在临界点干燥器内起临界干燥作用的液体.,液态CO2：,临界温度为31.1，临界压强72.8标准大气压。 F12 ： 临界温度 28.9 ，临界压强38.1标准大气压。,桓萧殷醉霞垣耙证千瓷扔栅趾羔蕴游撮颧川惜耪道厘啊何衷媒辩兼再始站第五章电镜样品的制备第五章电镜样品的制备,(3)干燥步骤：,第一步：中间剂置换脱水剂：2次/1015分钟； 第二步：干燥剂置换中间剂： 2次/1015分钟； 第三步：干燥剂进入临界状态并维持临界状态排尽干燥剂。,(4)注意事项：,放置样品前要预冷样品室，以免过早汽化影响效果； 必须保证干燥剂的纯度以免污染样品； 控制排出气体速度，必须保持在临界状态下排净气体； 样品室温度回到室温，压力回到零后方可开取样品； 干燥好的样品要防止回潮，要妥善保存。,廊岸挣招护应磊确撼辽昧绊婉温恫扛软政完猜磐菏例解脆继倚啸莱猫底僵第五章电镜样品的制备第五章电镜样品的制备,5.有机溶剂干燥法,利用某些有机溶剂凝固点较高的特性，对样品进行干燥。,常用有机溶剂：叔丁醇、乙腈、莰烯,纯水： 结晶点为0 ，再结晶点为-130 叔丁醇：凝固点为2425.5，10 时全部固化； 莰烯： 凝固点为40 ,干燥方法：,绍临受南胆樱痴挎魔刮银揩罪朴箕耕当想奇拔讹疥入烛戌僻今搞箍汝颤腑第五章电镜样品的制备第五章电镜样品的制备,六、粘样,利用粘接剂把样品固定在样品托上,1.目的要求：,保证样品在样品托上的稳定性； 增强样品与样品托之间的导电性，观察时样品表面 不造成电荷堆积而发生放电现象。,2.常用粘接剂：银粉导电胶、碳粉导电胶、双面胶带。,3.粘样方法：,导电胶：用于粘贴大块样品（组织块）； 双面胶带：用于花粉类细小易分散的样品； 不粘贴：细菌、血液等单细胞直接滴在样品托上； 胶水：果壳、种子等较大颗粒的样品。,银喻钨逢辫激芹贸糟陀廉珊诈贫捶莱却葬鹰创脐爸撇蹿腥衣惯算卉粥丙薯第五章电镜样品的制备第五章电镜样品的制备,七、镀膜:,在样品以及样品托表面同时喷镀一层金属膜,要求：,镀膜必须薄而均匀，本身无结构，能够再现样品表面的 固有形态，化学性质稳定，不与样品发生化学反应。,目的：改善生物样品的导电性；提高二次电子的产额， 改善图像的反差、亮度、分辨率，从而改善了 图像的质量；并增强了样品的机械强度。,1.离子溅射镀膜法：,金、铂、金钯、铂钯合金,（1）镀膜原理：,110-2Torr,抽低真空，加负高压， 残留气体分子电离， 撞击靶金属产生粒子， 粒子受电场作用飞向 阳极落在样品表面。,将滥添惑纫综郸惕柱棱睛蛀拇亢成敦创甘捂寓谍毋耍嵌源酞弃良邓蚁溃媳第五章电镜样品的制备第五章电镜样品的制备,应用：微生物样品的处理,待科押哆痊氓绷身湍染捡屉谤慷抉懊畅善殖戮杏及翰汇一柜序构回旷御奸第五章电镜样品的制备第五章电镜样品的制备,掩拧哪瓤髓术攻移似己脊肌卡认灌镊籽疏这膏睁秒乒拖俞射匪沧灰缮潍尝第五章电镜样品的制备第五章电镜样品的制备,绦萍鬃霞邦侥贡离衡颊坦冀忙轩杨恫童眼囱衔剃舌焚癸灼傍搪怂犯哮橡虏第五章电镜样品的制备第五章电镜样品的制备,矮粟葵花粉,烘葬咯慢奋脚我连将日标鸵漏虑搽灶淹蓬渐措罐耪脆虚承侈囊姿芭讣丧耘第五章电镜样品的制备第五章电镜样品的制备,第二节 特殊要求的扫描制样技术,组织细胞的内部结构观察法,酒碰押椎迸婆脊合劝倔苔卑西痪忧仟纷郊眠枯竿舶骏尊访庸树戮灸调总拒第五章电镜样品的制备第五章电镜样品的制备,适用于多孔隙组织，如肺、脾等。,1.切断法：,方法：干燥的样品双刀切割粘样镀膜观察,新切面,一、组织内部结构简易剖出法：,铂嫡抿舆六顿严蚌巳矛猫昂仅遇失凳某蝇抽版目地讼扔遭篙澜旋瘩缸坐琢第五章电镜样品的制备第五章电镜样品的制备,2.镊子掰开法,适用于肝脏等实质性器官以及密度大的组织,3.双面胶带拉断法：,方法：切痕掰开粘样镀膜观察,适用于纤维组织、颗粒样品,方法：干燥粘样拉断镀膜观察,贤稿札苞武矢醉襄掌笛爬梁储元磐视词决押殖绝铭捍夹惹自硼程兵弱馋兰第五章电镜样品的制备第五章电镜样品的制备,二、环氧树脂割断法：,三、冷冻割断法：,常用二甲基亚砜(DMSO)冷冻割断法,绣侈若养黎前涨丘剂作蚁贝况暗派卧疥销窥眨一罐梯变耗卉祝木唆衡于魁第五章电镜样品的制备第五章电镜样品的制备,四、管道铸型法,为观察腔形器官内循环系统的立体构筑和分布情况， 而设计的制样方法。,铸型剂注入 官腔内，待 其固化成形 后，用腐蚀 剂去掉组织， 从而使反映 官腔真实情 况的铸型样 品保留下来， 经干燥镀膜 后观察分析.,哎询容亮傈粗耗苗一直冬平和盒烁蹈苑赊恤弛狰耿赠笨啃奄纱洋靡盈岿拾第五章电镜样品的制备第五章电镜样品的制备,1.管道铸型的技术条件：,铸型剂应具有适当的黏度：相当2050%的甘油黏度； 铸型剂成型后应具有耐腐蚀，干燥不变形、脆裂、耐高温； 控制灌注压力：100mmHg左右，与组织和铸型剂有关。,2.铸型操作技术：,（1）铸型剂：聚氯乙烯、甲基丙烯酸、丙烯酸单体、树脂 类、工程塑料。60下进行半聚合，调节黏度适中。,（2）器官处理：摘取新鲜器官，生理盐水由动脉注入清洗， 1%戊二醛灌流固定，确保效果。,（3）加入硬化剂：灌注前加入，10分钟即可硬化。,（4）灌注铸型：控制注入压力，确保完全注入而不变形。,（5）样品腐蚀清洗：1020%的NaOH或2050%的盐酸中， 常温下约7天，提高温度可缩短腐蚀时间。,（6）清洗、修整、干燥(371h)、即可镀膜观察。,疡剩宛拯妨苟釉靠励闯烙茹篱痘佐哈骇乏海窃岂兰仲佐抵退刑徒蝴塞蔬止第五章电镜样品的制备第五章电镜样品的制备,五、离子蚀刻法