课件：肿瘤个性化治疗.pptx

,PCR技术在临床中的应用,这里写讲者姓名 这里写讲者信息1 这里写讲者信息2,目录,PCR技术背景 PCR技术在常规临床检测中的应用 PCR技术在肿瘤个性化治疗中的应用 PCR技术在其他个性化治疗中的应用,1、PCR技术背景,九十年代中期PCR临床应用在国内全面展开 1998年 荧光定量PCR技术开始在中国应用于临床检测,PCR (Polymerase Chain Reaction),1983 Cetus 公司的 Kary Mullis于12月16日第一 次成功实验发明了PCR 1985 关于PCR 的文章首次由 Kary Mullis及其同事等人 在Science上 发 表 1989 12月Science杂志将PCR和它所使用的Taq DNA聚合酶命名为第一个“年度分子”。 1993 Kary Mullis，Nobel Prize in Chemistry,1995 Perkin Elmer 公司研制出荧光定量PCR技术,循环次数 DNA的链数 1 21 2 2 22 4 3 23 8 10 210 1024 20 220 1,048,576 30 230 1,073,741,824 10亿,PCR循环次数与DNA产量关系,PCR特点：高效扩增、忠实复制,灵敏度高 快捷 简便 对样品纯度要求低 可以相对定量,PCR反应的特点,Ct值的意义,Ct值与重复性 同一样本在相同条件下同时进行96次扩增,FQ-PCR,Ct值与浓度 不同的模板达到荧光域值时的Ct值不同,2、PCR技术在临床常规检测中的应用,感染性疾病的诊断 母婴传播的控制与观察 遗传疾病的诊断 肿瘤的诊断 法医学鉴定,荧光定量PCR的临床应用,早期诊断 （超早期诊断） 病情评估和预后判断 抗病毒药物疗效的观察、指导 新药验证,一 感染性疾病 (埃博拉、登革热病毒) 1. 病原体含量与病情之间的关系 2. 病原体含量与用药之间的关系 3. 药物及疗法的研究与开发 4. 新的病原体分子诊断标准 5. 新的愈后指标 6. 传染病发病的监控、预测与预防,二 肿瘤(HPV-宫颈癌；EBV-鼻咽癌；HP-胃癌) 1. 肿瘤标志物：癌胚抗原、同功酶、抗体、激素、细胞因子、受体等 2. 肿瘤相关基因表达的检测：包括癌基因抗癌基因、肿瘤转移基因及转移抑制基因,遗传病 （a、b-地中海贫血、唐氏综合症、性别连锁遗传病） 1. 等位基因检测 2. 多基因遗传病的突变检测 3. 基因表达异常所致遗传病检测,3、PCR技术在肿瘤个性化治疗中的应用,EGFR基因突变检测 KRAS基因突变检测 BRAF基因突变检测 二氢嘧啶脱氧酶（DPD）基因突变检测 UGT1A1基因多态性检测,一、EGFR介绍及应用领域,肺癌居于我国恶性肿瘤死亡率之首，每年新增60万患者，其中非小细胞肺癌（NSCLC）占85%。,晚期NSCLC的治疗史,晚期NSCLC的治疗现状,病理分型,分子分型,INSR,EGFR基因突变检测是NSCLC靶向用药的必检项目,IPASS: 根据突变状态的疗效分析,0,4,8,12,16,20,24,Time from randomisation (months),0.0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,Probability of PFS,Gefitinib EGFR M+ (n=132) Gefitinib EGFR M- (n=91) Carboplatin / paclitaxel EGFR M+ (n=129) Carboplatin / paclitaxel EGFR M- (n=85),Gefitinib EGFR M+ (n=132) Gefitinib EGFR M- (n=91) Carboplatin / paclitaxel EGFR M+ (n=129) Carboplatin / paclitaxel EGFR M- (n=85),为什么要检测EGFR突变？,EGFR酪氨酸激酶区突变种类,EGFR突变类型与吉非替尼治疗敏感性,二、KRAS介绍及应用领域,2019/8/25,27,可编辑,K-ras基因是编码一个GTP结合蛋白的癌基因，其表达产物是EGFR信号传导通路上的重要蛋白。 K-ras基因突变一般会使结直肠癌和肺癌患者络氨酸激酶抑制剂产生耐药。,为什么进行KRAS基因检测？,为什么要进行K-ras基因检测？,用药原则： 08年NCCN结直肠癌临床实践指南指出：所有转移性结直肠癌患者都应检测K-ras基因状态；只有K-ras野生型患者才建议接受EGFR抑制剂（西妥昔单抗和帕尼单抗）或与化疗联合治疗。 09年NCCN非小细胞肺癌临床实践指南明确指出：当K-RAS基因如果发生了突变，则不建议病人使用特罗凯（Tarceva/厄洛替尼/Erlotinib）进行分子靶向治疗。,7个检测位点,三、BRAF介绍及应用领域,黑色素瘤概况,恶性黑色素瘤(黑色素瘤)是临床上较为常见的皮肤粘膜和色素膜恶性肿瘤，也是发病率增长最快的恶性肿瘤之一，年增长率为35。2010年全球黑色素瘤新发病例199 627例，死亡例数为46372例1。 虽然黑色素瘤在我国发病率较低，但近年来成倍增长，每年新发病例约2万例1。,1CSCO黑色素瘤专家委员会，中国黑色素瘤诊治指南(201 1版)，临床肿瘤杂志2012年2月第17卷第2期,BRAF基因与黑色素瘤,检测我国468例原发黑色素瘤标本，BRAF突变率为25,9其中BRAFV600E是最常见的突变位点(87)，这为中国患者使用BRAFV600E抑制剂(Vemurafenib)提供了理论基础1。 在103个治疗中心共入组了675例不能手术切除的期或期的初治黑色素瘤患者，结果Vemurafenib组的客观有效率达到48而达卡巴嗪(DTIC)组仅5.5，故在指南中也将Vemurafenib作为BRAFV600E 突变患者的一类证据推荐。,1CSCO黑色素瘤专家委员会，中国黑色素瘤诊治指南(201 1版) 临床肿瘤杂志2012年2月第17卷第2期,丝裂原活化蛋白激酶( MAPK) 信号转导通路,该通路在细胞的生长、分化和增殖中起着重要作用，通路通过 as、af、有丝分裂原活化蛋白激酶( MEK)及胞外信号调节激酶( EK) 的特异性级联磷酸化将信号由细胞外传入细胞核内2。,2董高超，周 湘，唐伟方，陆 涛.B-af 激酶抑制剂的研究进展J 中国药科大学学报2014，45( 1) : 1 9.,BRAF基因,RAF激酶家族有3个亚型: ARAF、BRAF和CRAF。这 3 个亚型均有 3 个保守区域 CR)：CR1、CR2 和 CR3。 研究表明BRAFV600E的催化活性比野生型 B-af 活性高 500 倍3,3Wan PTC，Garnett MJ，oe SM，et al Mechanism of activation of the AF-EK signaling pathway by oncogenic mutations of B-AFJ Cell，2004，116( 6) : 855 867.,四、DPD介绍及应用领域,DPD 个体差异:正常vs不足反应,8/25/2019,37,DPD基因变异的多态分布,8/25/2019,38,van Kuilenburg, 2004, Dihydropyrimidine dehydrogenase and the efficacy and toxicity of 5-fluorouracil, European Journal of Cancer，40(7): 939-950,五、UGT1A1介绍及应用领域,UGT1A1突变型的伊立替康毒副反应,8/25/2019,40,UGT1A1*28导致UGT1A1表达减少30%80%，SN-38G水平降低,使UGT1A1*28 变异患者腹泻和粒细胞减少危险性增高。,4、PCR技术在其他个性化治疗中的应用,CYP2C19基因多态性检测 CYP2C9盒VKORC1基因多态性检测 MTHFR基因多态性检测,一、CYP2C19基因多态性检测,CYP2C19基因分型氯吡格雷等,CYP2C19基因编码的S-美芬妥英羟化酶，是体内药物代谢的主要酶系的成员之一。 经由S-美芬妥英羟化酶代谢的临床常用药物，包括氯吡格雷、伏立康唑、质子抑制剂类药物、抗抑郁类药物、以及抗癫痫类药物等。,东方人弱代谢表型(PM)的99以上,氯吡格雷（波立维）是目前世界范围内使用最广泛的噻吩吡啶类抗血小板药，用于急性冠脉综合征、冠脉支架术和冠心病的一级二级预防，可以减少心血管疾病患者心脏病发作、卒中以及死亡的风险。,FDA建议药师可以通过检测CYP2C19的基因型来了解患者波立维的代谢能力，对于波立维弱代谢者可给患者选用其它抗凝血药物。,CYP2C19基因分型检测,CYP2C19属于CYP2家族的15个亚家族成员之一。其主要编码的S-美芬妥英羟化酶代谢一系列临床上的常用药物，在肝脏中有很多表达。,二、CYP2C9和VKORC1基因多态性检测,华法林（Warfarin）在临床上常用于治疗血栓性疾病 ,是目前国内外最常用的长效抗凝药，具有抗凝和溶栓的双重作用。 华法林血浆药物浓度和疗效存在明显的个体差异和种族差异。 鉴别对华法林药物敏感性增加的患者 能够快速确定华法林剂量范围 保证疗效，减少出血风险。,美国FDA批准在使用Warfarin前需检测CYP2C9和VKORC1等位基因状态,CYP2C9和VKORC1基因多态性华法林敏感性,Warfarin敏感性基因检测,检测目的基因：CYP2C9 和VKORC1 位点：5个SNP位点,凝血酶原时间 (PT) 国际标准化比率 (INR),VKORC1、CYP2C9,更有效、迅速地调整华法林维持剂量 达到疗效的同时减少华法林的出血风险,三、MTHFR基因多态性检测,亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)是叶酸代谢中的关键酶，第677位点基因发生突变可导致酶活性降低，引起叶酸代谢障碍，利用不足，可引发多种新生儿出生缺陷。,中国疾病预防与控制中心、妇幼保健中心于2008年发文，明确规定MTHFRC677T为妇女临床保健服务的遗传学检测项目。,MTHFR（C677T）各种基因型的酶活性及中国人群分布,MTHFR（C677T）基因突变,高同型半胱氨酸血症,MTHFR（C677T）基因突变者（TT 型）心脑血管疾病的风险显著增高,H 型高血压增加血管疾病风险 28 倍 。 MTHFR（C677T）基因 TT 型增加卒中风险 26%