课件：蛋白质的化学.ppt

第四章,蛋白质的化学,预习重点： 1.蛋白质的功能 2.氨基酸组成、分类、两性解离 3.氨基酸的分离分析 4.蛋白质的一级结构、肽键和肽链 5.维持蛋白质构象的化学键 6.蛋白质的二级结构 7.蛋白质的结构与功能 学习难点 ： 1.谷胱甘肽 2.蛋白质一级结构的测定 3.基序、三级结构、四级结构 4.蛋白质合成基本原理 5.蛋白质的性质 6.蛋白质分离纯化 7.蛋白质纯度鉴定,第一节,蛋白质是生命的物质基础,一、蛋白质是构成生物体的基本成分,二、蛋白质具有多样性的生物学功能,生物催化作用（酶） 代谢调节作用（激素） 免疫保护作用 （抗体） 转运和贮存作用（血红蛋白) 运动与支持作用（肌动蛋白、胶原蛋白） 控制生长和分化作用（核蛋白） 接受和传递信息作用（受体蛋白） 生物膜的功能,第二节,蛋白质的化学组成,各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16。,100克样品中蛋白质的含量 ( g% ) =每克样品含氮克数 6.25100,凯氏定氮法测定蛋白质含量:,定氮仪,一.蛋白质的元素组成：,二、蛋白质结构的基本单位氨基酸,组成蛋白质的氨基酸共有20种，称为基本氨基酸。,（一）基本氨基酸的结构通式,不同的-氨基酸，其R 侧链不同,除甘氨酸、脯氨酸外，基本氨基酸皆为L-氨基酸。,20种氨基酸的分类：根据R基不同，分为4类,（三）、氨基酸的化学性质,两性解离与等电点 紫外吸收性质 茚三酮反应,.两性解离,氨基酸在水溶液和晶体状态主要以兼性离子形式存在,等电点的定义：当溶液处于某一pH值时，氨基酸分子中所含的-NH3+和-COO-数目正好相等，净电荷为0。这一pH值即为氨基酸的等电点，简称pI。,每种氨基酸都有特定的等电点。在等电点时，氨基酸的溶解度最小。,等电点,在酸性溶液中 （pH pI）,在水溶液中 （pH=pI）,在碱性溶液中 （pHpI）,溶液pH影响氨基酸的羧基与氨基的解离程度,K1,C,O,O,H,2,N,CH3,K2,Ala+,Ala ,Ala,H,C,Asp+,Asp ,Asp ,Asp =,C,C,CH2,N +,3,H,O,O,H,举例：,.紫外吸收,在紫外区酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸光能力。 苯丙氨酸的max259nm 酪氨酸的max278nm 色氨酸的max279nm,蛋白质中含有这些芳香族氨基酸，所以也有紫外吸收能力。一般用紫外分光光度计在280nm波长下测定最大光吸收，而测定蛋白质的含量。,.茚三酮的反应,A.该反应非常灵敏， 测定范围：0.550g/ml B. 氨基酸与茚三酮，生成的蓝紫色化合物，在570nm测定吸光值 C.脯氨酸、羟脯氨酸与茚三酮生成黄色物质，在440nm处测吸光值 应用： A.氨基酸定量分析（纸层析法或者薄膜层析法分离） B.氨基酸自动分析仪,氨基酸的分离与分析,自动氨基酸分析仪 1.蛋白质完全酸水解 2.水解液于PH 2上样于钠型阳离子交换柱 3.用PH 3.5 0.2mol/L柠檬酸钠溶液洗脱 4.用PH 4.25 0.2mol/L柠檬酸钠溶液洗脱 5.分析洗脱谱上各峰的位置和面积，与标准氨基酸图谱比较分析 P66,第三节,蛋白质的分子结构,一级结构（决定空间结构）：又叫共价结构或基本结构，指蛋白质中不同氨基酸的种类、数量和排列顺序。,基序 结构域,（决定功能）,+,NH2-CH-C,R1,O,OH,肽键,由一分子氨基酸的羧基和另一分子氨基酸氨基缩合脱水而成。,概念：肽、 二肽、寡肽、多肽、多肽链,氨基酸残基: 多肽链中的氨基酸参与肽链的形成，已非原来完整的分子，称为氨基酸残基。 共价主链：多肽链中的骨干是由氨基酸的羧基与氨基形成的肽链部分规则的重复排列而成，称为共价主链。 侧链：多肽链中R基部分，称为侧链。,方向性：,书写方式：,N端写在左边，C端写在右边,命名：,从N端到C端,N 末端：多肽链中有自由氨基的一端 C 末端：多肽链中有自由羧基的一端,一级结构中化学键：肽键（主要）、二硫键（少量） 二硫键：由两分子半胱氨酸残基的巯基脱氢而成，存在于肽链内或肽链间,GSH过氧化物酶,GSH还原酶,NADPH+H+,NADP+,生物活性肽,1. 谷胱甘肽(GSH),体内许多激素属寡肽或多肽,2. 多肽类激素,二.蛋白质的一级结构测定 1.氨基酸组成的分析 蛋白质样品的纯化 蛋白质分子中多肽链数目的测定 氨基酸组成的分析： 氨基酸自动分析仪 含多个亚基的蛋白质，先纯化为单 个亚基，再测定每个亚基氨基酸组成,分析肽链的N-末端氨基酸 分析肽链的C-末端氨基酸,N末端氨基酸分析,A.二硝基氟苯（DNFB）法：P70 B.二甲氨基萘磺酰氯法（DNS-Cl）灵敏度：110-9mol。,C.Edman法（苯异硫氰酸，PITC法）：P71，蛋白质自动分析仪 D.氨肽酶法：肽链外切酶，从多肽链的N-端逐个水解氨基酸。,A.肼解法:,C末端氨基酸分析,B.羧肽酶法：肽链外切酶，从多肽链的C-端逐个水解氨基酸。,大分子多肽氨基酸顺序的确定：裂解 A.化学裂解法：溴化氰裂解法；羟胺NH2OH裂解法 B.酶裂法:胰蛋白酶，胃蛋白酶等,确定肽段在多肽链中的次序：重叠法 P72 利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。 16肽，端H 端 法裂解：ONS PS EOVE RLA HOWT 法裂解：SEO WTON VERL APS HO 重叠法确定序列：HOWTONSEOVERLAPS,核糖体,蛋白质链,5.核酸推导法,二、蛋白质的构象,蛋白质分子中原子和基团在三维空间上的排列、分布、及肽链走向。又称为空间结构、立体结构、高级结构和三维构象等。,蛋白质的分子构象包括：蛋白质的二级结构、三级结构、四级结构,（一）维持蛋白质构象的化学键,氢键、疏水键、盐键、配位键、二硫键、范德华力,1.氢键:由连接在一个电负性大的原子上的氢与另一电负性大的原子相互作用形成；多肽链主链骨架上羰基氧原子与亚氨基的氢原子间形成氢键维持二级结构的主要次级键；侧链间或主链间所生成的氢键是维持三、四级结构的主要化学键之一。,2.疏水键:两个非极性基团因避开水相而聚集在一起的作用力，维持蛋白质三、四级结构的主要次级键。,盐键：蛋白质分子中带正电荷集团和负电荷基团之间静电吸引所形成的化学键。,（二）蛋白质的二级结构,多肽主链原子的局部空间排列。即多肽链的主链骨架中若干肽单位，各自沿一定的轴盘旋或折叠，并以氢键为主要次级键形成有规则的构象。,肽单位：肽键与相邻的两个碳原子所组成的基团，又称肽平面。,肽键具有部分双键性质，不能自由旋转； 肽单位是刚性平面结构，肽单位的6个原子都位于同一平面上；,肽单位的特点：,-折角,蛋白质二级结构构象的种类：,角蛋白中的-螺旋和二硫键,（三）基序,多肽内顺序上相邻的二级结构在空间折叠中靠近，彼此相互作用，形成有规则的二级结构聚集体。,超二级结构的基本形式：,螺旋组合（） 折叠组合（） 螺旋折叠组合（）,（四）结构域,在较大的蛋白质分子中，由于多肽链上相邻的超二级结构紧密联系，进一步折叠形成一个或多个相对独立的致密的三维实体。,免疫球蛋白G的立体结构,（五）蛋白质的三级结构,一条多肽链中所有原子或基团在三维空间的整体排布。,主要化学键：,疏水键、 氢键、 盐键,2019/8/27,45,可编辑,（五）蛋白质的四级结构,由两个或两个以上的多肽链之间相互作用，彼此以非共价键相连而形成更复杂的构象，称为蛋白质的四级结构。每一条多肽链都有完整的三级结构，这每条多肽链称为蛋白质的一个亚基。,主要化学键：,疏水键、氢键、范德华力、盐键、二硫键,血红蛋白的一、二、三、四级结构,（一）肽的人工合成 保护（氨基、羧基、侧链活性基团） 活化（氨基、羧基） 缩合剂 （二）胰岛素的人工合成 （三）固相肽合成,五、肽与蛋白质的人工合成,第四节 蛋白质的结构与功能,蛋白质分子的一级结构是形成空间结构的物质基础。 蛋白质分子特定的天然构象是蛋白质生物功能的体现。,一、蛋白质一级结构与功能的关系,加压素,H2N- 半胱 酪- 苯丙- 谷胺 天胺 半胱-脯- 精-甘-CO-NH2,缩宫素,H2N- 半胱 酪- 亮- 谷胺 天胺 半胱-脯- 异亮-甘-CO-NH2,一级结构中关健部分相同，其功能相同,ACTH,人,猪,牛,一级结构关键部分的变化，其生物活性也改变,多肽或蛋白质 氨基酸位置 相对活性,脑啡肽（5肽） 衍生物,甘2 蛋5 D-丙 蛋-CO-NH2,1 10,P84,一级结构的变化与疾病的关系,例：镰刀形红细胞贫血,这种由遗传物质DNA突变引起的、在分子水平上仅存在微观差异而导致的疾病，称为“分子病”。,镰刀形红细胞,正常红细胞与镰刀形红细胞的扫描电镜图,正常红细胞,二、蛋白质的空间构象与功能的关系,1.蛋白质前体活化 P85 2.蛋白质变构 3.蛋白质构象改变与疾病,当配体与亚基（蛋白）结合后，引起该亚基构象变化，称为变构效应。,2、蛋白质变构效应,3.蛋白质构象改变与疾病,因蛋白质折叠错误或折叠导致构象异常变化引起的疾病，称为蛋白质构象病。,疯牛病是由朊病毒蛋白( PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。,不同生物与人的Cytc的AA差异数目,生物 AA差异数目 黑猩猩 0 恒河猴 1 兔 9 袋鼠 10 牛、猪、羊、狗 11 马 12 鸡、火鸡 13 响尾蛇 14 海龟 15 金枪鱼 21 角饺 23 小蝇 25 蛾 31 小麦 35 粗早链孢霉 43 酵母 44,三、蛋白质的结构与生物进化,第五节,蛋白质的性质,一、蛋白质分子的大小、形状及分子量的测定,分子量10000 蛋白质； 10000 多肽 P87 胰岛素分子量为5437，习惯上称为蛋白质,形状：根据其不对称常数，将蛋白质分为球形、椭圆 形、纤维状,分子量测定常用方法： 分子筛层析法 SDS-聚丙烯凝胶电泳（SDS-PAGE） 生物质谱,.分子筛层析法测定蛋白质分子量大小,凝胶颗粒,收集蛋白质管,蛋白质混合物,大分子,从柱上面加缓冲溶液,小分子,洗脱体积（Ve）,凝胶柱,大分子,小分子,Ve1,Ve2,V0,. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量大小,3.生物质谱（MS）测定蛋白质分子量大小,二、蛋白质的变性,某些理化因素使蛋白质分子的空间构象发生改变或破坏，导致其生物活性的丧失和一些理化性质的改变的现象。,变性作用的因素,物理因素：高温、紫外线、X-射线、超声波、剧烈振荡等,化学因素：强酸、强碱、尿素、去污剂、重金属、三氯醋酸、浓酒精等,变性作用的意义,变性的特征：,生物活性的丧失,某些理化因素 的改变,溶解度降低，易沉淀 不对称性增加 粘度增加 扩散系数降低 分子结构松散，易被水解,天然状态，有催化活性,尿素、 -巯基乙醇,去除尿素、 -巯基乙醇,非折叠状态，无活性,三、蛋白质的两性电离及等电点,蛋白质是两性电解质，其解离程度取决于所处溶液的酸碱度。,等电点（pI） 在某一pH的溶液中，蛋白质所带正负电荷相等，净电荷为零，此时溶液的pH值称为该蛋白质的等电点。,pH=pI,pHpI,pHpI,蛋白质的兼性离子,阳离子,阴离子,R,CH,四.蛋白质的胶体性质,水化膜,水化膜,蛋白质形成亲水胶体的因素： 蛋白质表面有水化层 蛋白质表面具有同种电荷,五、蛋白质的沉淀反应 蛋白质分子从溶液中析出的现象，称为蛋白 质的沉淀。 1.中性盐沉淀：硫酸铵、氯化钠 2.有机溶剂沉淀反应：乙醇、苯酚 3.加热沉淀反应： 4.重金属盐沉淀反应：重金属中毒 5.生物碱试剂：药检（三氯醋酸）,六、蛋白质的颜色反应 P93,1.茚三酮反应：氨基 2.双缩脲反应：肽键 3.酚试剂反应：酪氨酸、 色氨酸,七、蛋白质的免疫学性质,1.抗原，抗原性 2.抗体 单克隆抗体 多克隆抗体 3.蛋白质免疫性质的应用 免疫预防：疫苗 免疫、诊断治疗,二、蛋白质的分离与纯化,利用不同蛋白质溶解度不同、分子大小不同、电离性质不同、配基特异性不同确定使用不同的纯化方法,（一）利用溶解度不同的分离纯化方法,1.等电点沉淀 2.盐析沉淀 3.低温有机溶剂沉淀法 4.温度对蛋白质溶解度的影响,0-40之间，大部分蛋白质溶解度随温度升高而增加，40-50以上开始变性而沉淀。因此蛋白质分离一般在0或更低的温度下进行。,超过滤,加压,蛋白质溶液,半透膜,支持膜的栅板,超滤液,透析,（二）根据分子大小不同的分离纯化方法,1.透析和超过滤 2.凝胶过滤 3.密度梯度离心,2.分子排阻层析,未知,logMr,洗出液中的蛋白质浓度,洗脱体积（mL）,层析的主要设备,3.密度梯度离心法,滴加样品,蔗糖密度梯度,蔗糖浓度,CsCl密度梯度离心,（三）根据电离性质不同的分离纯化方法,1.电泳法：带点质点在电场中向电荷相反的方向移动。 醋酸纤维膜电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 等电聚焦电泳 免疫电泳 二维电泳 2.离子交换层析：离子交换纤维素、 离子交换凝胶、 大孔型离子交换树脂,等电聚焦电泳,2.离子交换层析分离蛋白质,NaCl梯度,（五）利用配体的特异性亲和力的纯化方法,应用 分离纯化酶、 抗原、抗体 分离纯化核酸 研究酶的结构与功能,a. 理论依据：待纯化分子和配体间具有亲和性,基质 纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、 sepharose、sephadex,亲和