课件：11胚胎工程实验之体外受精.ppt

动物胚胎工程实验,王子玉 84395381 逸夫楼3084,实验二 小鼠卵母细胞的体外受精,对畜牧业生产、动物生殖机理的研究及保护濒危动物、治疗人类的不孕不育症等具有重要意义 可望解决胚胎移植所需胚胎的生产成本及来源匿乏等关键问题。可利用IVMIVFIVC体外大规模生 产高质量的胚胎，建立工厂化生产胚胎的成套技术，以大量生产质优价廉的胚胎，大大加速品种改良进程。,体外受精的意义,能为动物克隆和转基因等其他胚胎生物技术提供丰富的实验材料和必要的研究手段 充分挖掘优良公母畜的繁殖潜力 评定家畜精子的质量,1978年 英国,由于正常受精过程的完成需要一个完全成熟的卵子和一个获得受精能力的精子，且其受精后需对其进行培养才能发育成为一个可移植的胚胎，因此，从广义上讲，体外受精技术又包含卵母细胞的体外成熟培养、精子的体外获能、体外受精、受精卵的体外培养等多项密切相关的技术。,一、实验目的,熟悉雄鼠的生殖器官的结构特点； 掌握从输卵管上取成熟卵母细胞的方法； 掌握从附睾尾部取精子的方法、精子的体外获能和体外受精方案、受精率的观察。,二、实验器材和材料,1. 器材及药品 体视显微镜，手术器械，1mL注射器，胶头滴管，口吸管，CO2培养箱，水浴锅，移液器，枪头，塑料培养皿，记号笔，血细胞计数板、载玻片、盖玻片。 0.1透明质酸酶，卵母细胞操作液（M2），精子操作液和受精液（T6），胚胎培养液（CZB，有糖和无糖）、激素（PMSG和HCG），石蜡油。,2实验动物,3-4周龄昆明系雌性小白鼠和8-12周龄雄鼠，自由采食饮水，控光一周以上，暗光时间20：00-6：00；光照时间6：00-20：00。,三、实验内容,1体内成熟卵母细胞的获取,超排方法：15：00腹腔注射PMSG10 IU/只小鼠。48小时后腹腔注射hCG10 IU/只。 注射hCG 后14-15h，利用颈椎脱臼法处死小鼠（方法同实验一），取输卵管于M2操作液中，清洗两次，在体视显微镜下用眼科镊子撕开输卵管壶腹部释放出卵丘卵母细胞复合体团，用口吸管吹打几次，把COC团分散开。,IVM卵母细胞（小鼠）,2体外受精,21 取附睾尾部精子 选取性成熟（8周）昆明白雄鼠，已通过交配实验证明其有受精能力，颈椎脱臼法杀雄鼠，打开腹腔，将附睾尾部和输精管剪下，剔除脂肪，在实体显微镜下，用镊子和针头配合，挤出输精管内精子。针头刺破附睾尾部上皮，挤压出精子（图2-1）。,大鼠（公）,22精子的洗涤,在小鼠上可省略（从附睾尾部取精子），但在大动物上必需（射出精液），洗涤可除去获能抑制因子、卵黄、甘油等。,23精子的获能,马上收集精子团块，置于1.5mL离心管中，加入1mL含10mg/mLBSA的 T6，轻微振荡几次，使精子团分散开，用封口膜封口，于37.5，5CO2，95空气，100 湿度的CO2培养箱内中孵育1.5h左右。,发展中的南京农业大学动物胚胎工程技术中心,24精液品质检测,主要检测活力和密度，方法参考动物繁殖学实验教程。,附：精液品质检查,精液品质检查 (semen quality measurement)是为了鉴别精液质量的优劣。评定的各项指标，既是确定精液取舍、新鲜精液进行稀释保存的依据，又能反映雄性动物饲养管理水平和其生殖器官的机能状态。 因此，常用作诊断公畜不育或确定其种用价值的重要手段，同时也是衡量精液在稀释、保存和运输过程中的品质变化和处理效果的重要判断依据。,指 标,精子活力 (motility) 精子活力是指精液中呈前迸运动的精子所占百分率，也称活率。由于它与精子的受精能力直接相关，所以是评价精液品质的一个重要指标。通常在采精后，精液处理前、后，冷冻精液解冻后和输精前进行检查 精子密度 每mL中精子的数目（细胞计数板）,精子顶体异常率 (abnormal acrosome rate)： 精子顶体在受精过程中具有重要作用，一般认为只有呈前进运动、且顶体完整的精子才具有正常受精能力。,精子畸形率 (ASR)： 凡形态和结构不正常的精子通称为畸形精子。在正常精液中也有一定比例的畸形精子，但一般不会超20%。优质精液，精子畸形率不能超过如下数值:牛18%，水牛15%，羊14%，猪18%，马12%，,25体外受精,将成熟的COC移入已经平衡2h的受精滴中（T6+20mg/mL），加入适量体积的获能精子，使精子密度在1106右，置于培养箱中孵育8h，观察原核形成和第二极体排出，计算受精率。,体外受精质量的评定,体外受精成功的判断指标： 精子穿透率 原核形成率 卵裂率 囊胚率 通过染色或胚胎培养,3胚胎培养,洗去精子，将胚胎换液于无糖CZB继续培养。胚胎过阻断之后（4cell）换为含葡萄糖的CZB，换液时间在有1/3的胚胎到达4cell后进行，大约在受精后36h48h之间。 在受精后24h、48h、72h、96h各观察一次，记录2cell、4cell、桑椹胚、囊胚的发育情况。,四、作业,1计算本实验的受精率、卵裂率和囊胚发育率。,2简述实验中的注意事项。 3简述体外受精的步骤。,THANKS!,哺乳动物正常体内受精 为了提高动物繁殖率，家畜体外受精技术在20世纪80年代初研究成功，并在近10年得到逐步完善。 体外受精（IVF）：指用经特殊处理的精子在体外使卵母细胞受精的技术。经IVF-ET所生的婴儿称试管婴儿。,二、体外受精概述,发情周期观察超排活体取卵（或屠宰场卵巢卵母细胞的体外成熟） 采精精液品质检测精子体外获能 体外受精（或ICSI） 胚胎质量检测胚胎移植妊娠分娩,技术流程,卵子的收集和处理,体内：（超排后从卵巢或输卵管内） 体外：屠宰场的卵巢 本实验用小鼠卵巢,Egg retrieval, detail view,未成熟卵母细胞,脱去卵丘的未成熟卵母细胞,GVBD,成熟的卵母细胞,IVM卵母细胞（小鼠）,放射冠,透明带,卵质膜,卵母细胞,极体,1,3,2,精子入卵的三道屏障： 扩展的卵丘 透明带 卵质膜,弱精、畸精、少精症患者的精子很难穿越三道屏障,卵 巢,卵巢大多呈卵圆形，都成对存在。 由于各级卵泡及排卵后出现的一系列变化，致使牛、猪卵巢表面凹凸不平。 卵巢位置是半游离的，系于卵巢系膜上。 猪：青年猪为椭圆形，较小；多胎次后呈葡萄串状。,卵巢为实质器官，实质为各级卵泡，包括原始卵泡、初级卵泡、生长卵泡和成熟卵泡。 原始卵泡数量很多，但能成熟的卵泡很少，绝大部分退化成为闭锁卵泡。 成熟卵泡排出卵细胞后，形成红体，随后形成黄体。黄体退化后由结缔组织填充，而成为白体。,2.1.1卵泡发育和排卵,卵巢皮质部表层聚集着许多原始卵泡，由一个卵原细胞和周围的单层扁平卵泡细胞组成。 成熟：随着卵泡的发育，经过初级卵泡、次级卵泡、生长卵泡和成熟卵泡阶段，卵原细胞经过初级卵母细胞、次级卵母细胞，最终发育为卵子，由卵巢排出。,黄体及白体,子 宫,子宫是胎儿生长发育和娩出的器官。 子宫 (uterus)大部分位于腹腔，少部分位于骨盆腔。背侧为直肠。腹侧为膀胱，前接输卵管，后接阴道，借助于子宫阔韧带悬于腰下腹腔。 子宫角子宫体子宫颈,牛的子宫,猪的子宫,2.卵子发生,卵子是受精的基础，作为配子的一方，在卵泡中逐渐发育成熟。 精子：提供遗传物质 卵子：提供遗传物质，提供支持早期胚胎发育的营养,2.1卵子形态结构,哺乳动物的卵子为圆球形，其直径大小因所含的卵黄量不同，变异范围较大，透明带内卵黄的直径为80200um，为精子体积的1万倍。 家畜卵的直径一般小于185um，牛为120140um，绵羊140185um，猪120170um。,2019/9/1,69,可编辑,雌性生殖细胞的分化、增殖、成熟全过程称为卵子发生 (oogenesis)。 卵子发生起始于胚胎早期，由原始卵原细胞经过有丝分裂、减数分裂最后成为单倍体的卵细胞，持续时间很长，一般在初情期以后开始，至受精过程中才能完成。,2.2卵子发生特点,卵子发生和精子发生的过程很相似，都要经过增殖期、生长期和成熟期三个阶段，但与精子发生相比也有许多不同之处。 首先，卵原细胞经过有丝分裂的增殖形成初级卵母细胞 ，初级卵母细胞经过两次减数分裂，每次分裂均生成大小不等的两个细胞，小的称为极体。多余的染色体被排出，最后形成一个成熟的卵子。,其次，哺乳动物的卵原细胞分裂形成初级卵母细胞都是在胎儿出生以前或出生后不久完成的。 在动物性成熟以前，卵母细胞不再增长，停留在第一次减数分裂前期。 到性成熟以后，每个性周期都会有部分卵母细胞发育，但多数卵母细胞在发育过程中退化，只有少数卵母细胞发育到成熟并排卵。,卵母细胞在生长发育过程中要积累大量的营养物质和遗传信息，为胚胎发育提供营养和信息。 尽管哺乳动物的胚胎是在母体子宫内发育，可以直接吸收母体的营养物质，不像鸟类、两栖类、爬行类动物的卵需要存贮大量的卵黄物质，但一些母源性mRNA.tRNA.rRNA的合成还是必需的。,三、卵的采集及体外成熟（实验）,1.卵母细胞的离体采集 母畜屠宰后，在30min内取出卵巢，放入盛有灭菌生理盐水或PBS的保温瓶内（2535）中，在3h内送回实验室，然后按照下述方法进行回收。 卵泡抽吸法： 用注射器套上1216号针头，保持一定负压，从卵泡的侧面刺入，一次进针可抽吸卵巢皮质的多个卵泡。 卵泡解剖法： 用手术刀片将卵巢切为两半，去掉中间的髄质部分，露出卵泡，然后用刀片划破卵泡，在培养液中反复冲洗，采集其中的卵母细胞。,（一）卵母细胞的采集方法,2.卵母细胞的活体采集 因从屠宰场收集得到的卵巢无法知道其系谱，且其种质一般相对较差，所以卵母细胞的活体采集是通过体外受精技术生产良种胚胎的一种主要途径。如今，活体采卵已成为当今应用体外受精和胚胎移植的一项关键技术。 腹腔镜法： B型超声波法：,Egg retrieval, ultrasound image,GIFT procedure, gamete intrafal-lopian transfer, laparoscopy 配子输卵管内移植（GIFT）,（二）卵母细胞的筛选,只有周围包被着完整卵丘（A级）或部分卵丘脱落（B级）、胞浆均质并充满于透明带内的卵母细胞才能进行成熟与胚胎发育的培养。,（三）卵母细胞的体外成熟方法,37-39度，5二氧化碳，100湿度 1.成熟培养液的选择 基础培养液TCM199中的核苷、黄嘌呤和次黄嘌呤等对卵母细胞核成熟有抑制作用的成分浓度较低，培养的效果相对较好。 体外成熟培养卵母细胞还要在基础液加入一定浓度的血清（510的FCS或ECS）和促性腺素（0.11.0g/ml FSH和510g /ml LH等）等成分。 2.成熟培养的时间 对大多数家畜来讲，卵母细胞的成熟培养时间一般采用2224h，但是也要依据动物而定。,3.成熟培养的温度和气相环境 温度：目前，除人和啮齿类动物的卵母细胞体外成熟仍采用37外，牛、猪、羊和马等家畜的卵母细胞成熟培养温度均采用3839。 气象环境： CO2的浓度：应根据培养液中的碳酸氢盐来定。由于目前培养液中NaHCO3浓度多为2530mmol/L，故一般都采用5的CO2。 4.成熟培养的系统 大致可分为三大类。 开放培养系统： 将12ml成熟培养液直接置于平面皿内或五孔培养板内，然后放入50200枚卵母细胞进行培养，上面不覆盖石蜡油。,微滴培养系统： 将成熟培养液先在组织培养皿中做成50500l的微滴，上覆石蜡油，然后将卵母细胞置于其中培养。 在一般情况下，这种培养液用在卵母细胞数量特别少的情况下采用。 密闭培养系统： 将卵母细胞置于含有12ml成熟培养液的试管中，加盖胶塞，然后在培养箱或恒温水浴中培养；如若采用培养皿或微滴培养，则可将其装入一个密闭的塑料袋内。,IVF, in vitro fertilization, process,受精是两性配子 (精子和卵子)相互作用，结合产生新的个体即合子(zygote)的过程。 通过受精，单倍体的雌、雄生殖细胞共同构成双倍体的合子(又称受精卵)，合子是新生命发育的起点。 哺乳动物受精部位：输卵管壶腹部。,有极少数的精子到达输卵管壶腹部。主要是由于精子从射精部位到达受精部位需要闯过三道关卡，即经过三次筛选： 第一道关卡子宫颈。 第二道关卡子宫内膜腺。 第三道关卡输卵管壶腹部和峡部的连接部。,刚射出的精子不能穿入卵子，而只有在雌性生殖道内度过一段时间之后，才获得受精能力，称为“获能”(capacitation)。,三、精子获能,精子获能后，能释放出一系列水解酶，可将包围在卵子周围的细胞和生物大分子物质(蛋白质和黏多糖)溶解出一条通路，便于精子进入卵母细胞。 获能过程先在子宫内进行，最后在输卵管内完成。,顶体反应(acrosome reaction)：包裹精子头部的质膜、顶体外膜融合和破裂，释放顶体内含物的过程。 这一反应是精子与卵子融合前必须经历的反应之一，也是精子获能后的必然结果。,四、顶体反应,受精过程始于精子与卵子相遇，两性原核合并形成合子时结束，分为五个步骤： 精子穿过放射冠 精子穿过透明带 精子穿过卵质膜 原核形成 配子配合,五、受精的过程,原核形成,精子入卵后不久，头部开始膨大，核疏松，核膜消失，失去固有的形态，最后在疏松的染色质外又形成新的核膜，这种重新形成的核叫雄原核。 同时卵母细胞减数分裂恢复，释放第二极体。卵中的染色质外又形成新的核膜，称雌原核。,配子配合,雄原核和雌原核经充分发育，逐渐相向移动。在卵子中央，核仁和核膜消失，两原核紧密接触，然后迅速收缩，染色体重新组合，并准备进行第一次有丝分裂，形成一个称为“合子”的单细胞胚胎。,第二节 体外受精,一、概述 二、精子的制备及获能 三、卵的采集及体外成熟 四、体外受精的方法 五、体外受精质量的评定 六、早期胚胎的体外培养 七、影响体外受精的因素,1998年我国首例试管婴儿诞生10周年时，张丽珠与郑萌珠在一起。北京医科大学第三医院,2.历史,1978年7月25日，第一例试管婴儿Louise Brown在英国诞生，这是体外受精技术走向全面应用的标志性事件，是医学和生物学上的一次伟大的革命。 而早在1878年，德国科学家Schenk就开始进行哺乳动物卵子体外受精的尝试。 1890年，Heape用人工授精和体外受精技术研究兔的胚胎移植，胚胎可成功发育直至降生。,直至20世纪40年代，世界上也只有为数不多的科学家能成功的进行哺乳动物体外受精试验。美国的Pincus和日本的Yamane是这时期的代表。 美籍华人张明觉在1945年曾成功的进行了兔体外受精，但在此后的5年里没有能再重复出这一结果。这个时期的体外受精工作主要建立在经验基础上。,1951年，Chang和澳大利亚的Austin几乎同时发现只有在雌性生殖道内停留一段时间的精子才能成功的与卵结合，进行体外受精。精子获能现象的发现是体外受精史上的一个里程碑。 1959年，Chang利用体内获能处理的精子进行体外受精实验，获得世界上首例“试管动物”试管兔，为哺乳动物体外受精工程奠定了基础。,1963年，Yanagimachi和Chang首次报道了成功进行精子体外获能的实验（金黄仓鼠）。 1970年，Mukherjee和Cohen，小鼠。 1978年7月25日，第一例试管婴儿Louise Brown在英国诞生（Steptoe和Edwards），这是体外受精技术走向全面应用的标志性事件，是医学和生物学上的一次伟大的革命。,1989年，陈大元等首次成功进行大熊猫精子体外获能，体外获能的大熊猫精子能与金黄地鼠卵子相互作用。 1990年，Miller和Ax相继进行了美洲虎和美洲豹的体外受精，并于同年获得美洲虎体外受精后代。,80年代以来，由于对胚胎需求量的加大，促进了家畜体外受精的研究，牛、羊、猪等相继获得了成功，国内在80-90年代也在家畜上取得了成功。 现已将卵母细胞体外成熟体外受精早期胚体外发育，甚至冷冻保存结合在一起，建立工厂化生产胚胎的成套技术，以大量生产质优价廉的胚胎。,与人工授精相比，体外受精所需精子数减少，精液利用率提高。,二、精子的制备及获能,1.取精,大鼠（公）,2.精子的分离与制备是IVF的一个关键环节,精液中的精子获能抑制因子 冷冻精液中的防冻剂和蛋黄等成分 影响和干扰受精的完成 过多的留在受精液中的死精子, 悬浮法（swim up）： 是筛选高活力精子最为有效的一种方法。 玻璃棉（glasswool）过滤法： 该法可有效地滤除品质较差精液中的死精子，大大提高精子的受精穿透率。,方法：, BSA/哌可（Percoll）密度梯度离心法： 采用不连续的BSA密度梯度可以分离得到形态正常的高活力精子。 离心洗涤法： 对于精子活力较好的精液可采用直接离心洗涤法制备用于体外受精的精子。,3.精子获能原理,任何可导致精子被膜蛋白脱除，质膜稳定性下降，通透性增加和Ca2+ 内流的处理方法，均能诱发精子的获能。 精子获能后发生一系列明显变化，代谢活动显著增强，摄氧量增加2-4倍，运动速度加快，头部膨大，极易发生顶体反应。,体内获能：把精子送入结扎的子宫角或输卵管中孵育, 与血清白蛋白的溶液长时间孵育： 原理是血清中白蛋白具有很强结合胆固醇和锌离子的能力，可除去质膜中部分胆固醇和锌离子，改变精子质膜的稳定性，导致精子获能。 用高离子强度溶液处理精子： 精子表面的去能因子（被膜蛋白），当用高离子强度溶液处理精子时，将从精子的表面脱落，从而导致精子获能。 与含有卵泡液的培养液进行孵育：,4. 精子体外获能的方法, 使用钙离子载体A23187： 直接诱发Ca2+进入精子细胞内部，提高细胞内的Ca2+浓度，从而导致精子获能。 使用肝素： 是一种高度硫酸化的氨基多糖类化合物，当它与精子结合后，能引起Ca2+进入精子细胞内部而导致精子的获能。是一种接近于体内获能的生理性方法，已经成为动物体外受精应用最广的一种精子获能方法。,四、体外受精的方法,体外受精的完成需要一个有利于精子和卵子存活的培养系统。 微滴法： 是在塑料培养皿中用受精液做成2040l的微滴，上覆石蜡油，然后每滴放入体外成熟的卵母细胞1020枚及获能处理的精子（1.01.5）106个/ml，在培养箱中孵育624h。,四孔培养板法： 每孔加入500l受精液和100150枚体外成熟的卵母细胞，然后加入获能处理的精子（1.01.5）106个/ml，而后在培养箱中孵育624h。,五、体外受精质量的评定,体外受精成功的判断指标： 精子穿透率 原核形成率 卵裂率 囊胚率 通过染色或胚胎培养,六、早期胚胎的体外培养,对于一些采用非手术法将胚胎移植的家畜来说，体外受精后的早期胚胎必须在体外培养至桑椹胚或囊胚阶段才能移植；而对于那些采用手术法移植胚胎的动物，将受精卵培养成囊胚再移植，亦有可能提高移植妊娠率，因体外受精的胚胎并不是都能发育到囊胚阶段。 因此，早期胚胎的体外培养是胚胎体外生产技术中非常关键的一个环节。,（一）胚胎体外培养的发育阻断 随着胚胎的发育，合子的基因开始启动转录，其代谢活动逐步由母源的mRNA控制向合子本身的mRNA控制过渡，在这一过渡时期，胚胎对所处的环境条件特别敏感，稍有不适便表现出不可逆的发育阻断。（门槛）,在进行哺乳动物胚胎体外培养时，若胚胎所处的条件不当，就会出现体外发育阻断，即早期胚胎停顿在某个特定时期，甚至不能发育。 在体内正常的生理条件下，胚胎从输卵管和子宫腺体壁吸取营养，保证其正常的发育。 体外模拟动物体内的环境条件,发育阻断的出现时间与合子基因启动的时间有关，而且发育阻断的出现与否也是胚胎质量和培养条件相互作用的结果，在一定的培养条件下，某些特定品系的多数胚胎不表现发育阻断，而通过改善培养条件亦能提高通过发育阻断的胚胎比率。 小鼠：2细胞 牛羊：8-16细胞 猪： 4细胞 人： 4-8细胞,使胚胎通过发育阻断，一直是胚胎体外培养研究的热点。 经过多年的研究，与体细胞共培养是促使胚胎通过发育阻断最为有效的途径，而且随着近几年研究工作的不断深入，胚胎发育阻断也可以通过改善培养条件和在培养液中添加生长因子（TGF和bFGF等）或细胞外基质因子（如肝素纤粘蛋白）克服。,（二）培养液的基本成分及其功能 培养液的基本成分主要包括无机盐、氨基酸、维生素、碳水化合物和蛋白质等，按其功能可分为渗透压维持因子、代谢底物和代谢调节因子等。 1.无机盐：培养液中主要包括Na+、Cl、K+、Mg2+、Ca2+、PO43、SO42和HCO3等。 2.能量底物：主要包括葡萄糖、乳酸钠、丙酮酸钠和谷氨酰氨等。,3.氨基酸：是蛋白质合成的前体，也参与胚胎的能量代谢，就单一氨基酸的作用而论，天冬氨酸、天冬酰氨、甘氨酸、组氨酸对胚胎发育均起促进作用，而半胱氨酸、亮氨酸、苏氨酸和颉氨酸起抑制作用。 4.维生素：它作为碳水化合物