基因工程及其在食品科学中的应.ppt

第二章 基因工程及其在食品科学中的应用,基因工程基础 基因工程研究方法 基因工程在食品科学中的应用,第一节 基因工程基础,一、基因工程的定义、意义及研究内容 （一）基因工程的定义 gene engineering genetic engineering recombinant DNA technique Molecular cloning （二）基因工程的意义 基因工程是现代生物工程的主体核心技术。基因工程的最大特点是可打破生物种属界限，进行生物种(属、科、目、纲、门、界)内外基因的重组、遗传信息的转移。 遗传病、心脑血管病、糖尿病、癌症过度肥胖综合症、老年痴呆症、骨质疏松症,（三）基因工程的研究内容,制备目的基因,构建重组DNA,获得转化体,筛选出重组转化体阳性克隆,筛目的基因在受体生物 细胞中高效表达隆,二、基因工程的工具酶 基因工程的关键技术之一就是先将目的基因DNA从供体生物体中分离出来，再与合适载体DNA连接重组等，这些分子操作涉及多种不同的酶。主要包括： 限制性内切核酸酶 DNA甲基化酶、 DNA聚合酶 依赖于DNA的RNA聚合酶 连接酶 激酶 磷酸酶 核酸酶,（一）限制性内切核酸酶与DNA甲基化酶 1、定义 restriction endonuclease：指一类能够识别和切割双链DNA分子内核苷酸序列的内切核酸酶 DNA methylase ：是指一类能够识别DNA特定序列，并在其特定碱基的特定位置上引入甲基而发生修饰作用的酶 2、限制性酶（甲基化酶）的命名和分类 (1) 限制酶(甲基化酶)的命名 其命名主要是参照HOSmith和D. Nathans提出的待命名酶的供体微生物的属名与种名相结合的原则进行的，具体如下：, 以属名的第一个字母(大写)和种名的最前两个字母(小写)组成的三字母符号为其基本形式 如：来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的酶用Eco表示；来源于流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)的用Hin表示 当同属不同种的两种微生物的种名前两个字母完全相同时，则来自后一种微生物的酶的符号改用其种名词头前缀后第一个字母(小写)代替上述三字母符号中的最后一个字母 如：来自Haemophilus parainfluenzae (副流感嗜血杆菌)的用Hpa表示，而来自同一属的Haemophilus parahaemolyticus (副溶血嗜血杆菌)的则用Hph表示。, 当微生物具有特殊名称时，则将代表该特殊名称的符号置于上述三字母符号之后 如：来自Haemophilus influenzae的Rd株的用Hind表示；来自Haemophilus influenzae的Rf型的用Hinf表示。 当不止一种限制酶(甲基化酶)分离纯化自同一微生物株系时，则依其被分离的先后顺序以罗马数字(大写)置于上述命名符号之后 如：来自Haemophilus aegytius的三种酶分别用Hae I、Hae和Hae表示；来自Haemophilus influenzae的Rd株的三种酶分别用Hind I、Hind和Hind表示。, 为了区别起见，在上述命名名称之前加R表示限制酶类；在上述命名名称之前加M表示甲基化酶类 如：来自Haemophilus influenzae的Rd株的第三种限制性内切核酸酶为R. Hind，其相应的DNA甲基化酶则为M. Hind。,大鼠生长激素基因转入小鼠,(2) 限制酶的分类 根据酶的性质，可将限制酶分为三个类型: I型: 三种不同亚基组成；辅助因子为ATP、Mg2+及S-腺苷甲硫氨酸 其切割位点距其识别位点至少1000bp；且切割作用是随机的 型: 两个相同亚基组成；辅助因子仅为Mg2+；其识别位点常具旋转 对称性；其切割位点与其识别位点重叠或在其附近；且切割作 用特异性强 型: 两种不同亚基组成；辅助因子为ATP和Mg2+，也受S-腺苷甲硫 氨酸激活，但并非必需；其切割位点一般在距其识别位点3端 2426bp处,PstI 5-C TGCA G-3 3-G ACGT C-5 HpaI 5-GTT AAC-3 3-CAA TTG-5,限制性内切酶的旋转对称性,需要指出的是，I型和型限制性内切核酸酶均兼具限制酶活性和甲基化酶活性；而对型限制性内切核酸酶而言，其只具限制酶活性，与其相应的DNA甲基化酶才具甲基化酶活性。型限制性内切核酸酶及其相应的DNA甲基化酶对DNA有相同的识别序列。,(3)型限制性内切核酸酶的基本特性 识别序列与切割位点 型限制性内切核酸酶可识别长度为47bp的双链DNA特定序列，该识别序列(识别位点)常呈旋转对称性 切割方式 平齐末端 、5磷酸端25个核苷酸突出单链黏性末端 、3-羟基端25个核苷酸突出单链黏性末端,型限制性内切核酸酶切割方式, 同裂酶与同尾酶 isoschizomer ：在型限制性内切核酸酶中，来源不同而识别序列和切割方式均相同者 如：Hpa和Msp I两者的识别序列都是CCGG，切割方式也相同，因此二者为同裂酶 isocaudamer ：来源及识别序列不同，但DNA经其切割后能形成相同黏性末端者 如：BamH I、Bcl I、Bgl、Mbo I、Sau3A I及Xho切割DNA后都形成相同的GATC四核苷酸突出单链黏性末端，因此其为一组同尾酶 需要指出的是，由同尾酶切割DNA所得到的黏性末端可以彼此连接起来，但是不能重新切开，即原来同尾酶的识别序列都已不再存在。, 限制性片段长度与切割频率 经限制性内切核酸酶切割后产生的DNA片段称为限制性片段(restriction fragment)。一般不同限制酶切割DNA后所形成的限制性片段长度不一 假设在某DNA分子中，A或T出现的频率为X，G或C出现的频率为Y，那么某限制酶在该DNA分子上的切割位点出现频率(切割频率或位点频率) F可用下式表示： F=XnYm 式中：n该限制酶识别序列中双链A=T碱基对的数目；m该限制酶识别序列中双链G=C碱基对的数目,如果构成某DNA分子的碱基对总数目(B)及某限制酶识别位点核苷酸序列均为已知，那么该限制酶在该DNA分子上的理论切割位点数目(N)为： N=BF 假定在某DNA分子中四种核苷酸残基数量相等，那么识别序列为四个碱基对的限制酶在该DNA分子中切割位点出现频率为(14)4，即1256，也即平均256个碱基对出现1个切割位点。 同样，识别序列为六个碱基对的限制酶在该DNA分子中切割位点出现频率为(14)6，即14096，也即平均4096个碱基对出现1个切割位点。 需要指出的是：实际情况与理论不相符,(4) 影响限制性核酸内切酶活性的主要因素及优化策略 底物DNA制备物的纯度：蛋白质、SDS、EDTA、酚、氯仿、乙醇及高浓度的盐离子等污染物都会抑制限制酶的活性。 底物DNA的甲基化程度：大肠杆菌的绝大多数菌株含有两种DNA甲基化酶：a、dam甲基化酶；b、dcm甲基化酶。 底物DNA的结构构型：环状双螺旋DNA较线性DNA稳定。因此，在用限制性酶酶解同样分子量的DNA时，环状双螺旋DNA所需酶量为线性DNA的1020倍。 酶反应缓冲液的组成： 酶反应的最适温度：,为了提高限制酶对底物DNA低纯度制备物的反应效率，一般采用如下方法： a 增加限制酶的用量(平均每g底物DNA可用10IU甚至更多些)； b 延长酶催化反应的保温时间，使酶解更完全； c 扩大酶催化反应的体积，使潜在的抑制因素被稀释，以减弱其抑制作用； d 在反应液中加入适量亚精胺(一般应用浓度为12.5mmolL)，以利限制酶对基因组DNA的酶解作用。,(5) 限制性内切核酸酶酶解反应的操作步骤及注意要点 (二) DNA聚合酶 最常用的依赖于DNA的DNA聚合酶有大肠杆菌DNA聚合酶I(全酶)、大肠杆菌DNA聚合酶I大片段(Klenow片段)、T4噬菌体编码的DNA聚合酶、耐热的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)等 依赖于RNA的DNA聚合酶，即逆转录酶，优先以RNA为模板，也可以DNA为模板，因此该聚合酶能以RNA为模板催化合成双链DNA,1、大肠杆菌DNA聚合酶I(全酶) 来源：大肠杆菌； 分子量：109103的多肽链 （1）作用 具有53DNA聚合酶活性，以单链DNA为模板，以带3自由羟基的DNA片段为引物； 53外切核酸酶活性，从5端既降解双链DNA，也降解RNA-DNA杂交体中的RNA链(RNA酶H活性)； 35外切核酸酶活性，底物为带3自由羟基的双链DNA或单链DNA。 （2）主要用途 以切刻平移法(nick translation)标记DNA。在所有聚合酶中，只有该酶能用于此反应，因为只有其具有53外切核酸酶活性。 对DNA分子的3突出尾进行末端标记。,DNA 聚合酶,2、大肠杆菌DNA聚合酶I大片段(Klenow片段) 来源：由大肠杆菌DNA聚合酶I全酶经枯草杆菌蛋白酶酶解获得，也可通过克隆技术获得。 分子量：76103的多肽链 （1）作用 53DNA聚合酶活性，以单链DNA为模板，以带3自由羟基的DNA片段为引物； 35外切核酸酶活性，底物为带3自由羟基的双链DNA或单链DNA。 （2）主要用途 补平限制酶切割双链DNA所产生的3凹端； 如果以标记的dNTP补平双链DNA的3凹端，那么可对DNA分子进行末端标记； 对DNA分子的3突出尾进行末端标记； 在cDNA克隆中，合成cDNA第二链； 应用Sanger双脱氧链末端终止法进行DNA测序。,Klenow 酶的作用方式,3、T4噬菌体DNA聚合酶 来源：T4噬菌体感染的大肠杆菌 分子量：114103 （1）作用 53DNA聚合酶活性，以单链DNA为模板，以带3自由羟基的DNA片段为引物； 35外切核酸酶活性，底物为带3自由羟基的双链DNA或单链DNA； （2）主要用途 补平限制酶切割双链DNA产生的3凹端； 如果以标记的dNTP补平双链DNA的3凹端，那么可对DNA分子进行末端标记； 对DNA分子的3突出尾进行末端标记，并且该酶为利用此法进行此类末端标记的首选酶； 将双链DNA的突出端转化成平齐端。在制备与合成接头连接的双链DNA时，经常利用这一特性。,4、TaqDNA聚合酶 来源：水生栖热菌(Thermus aquaticus)，现可由基因工程途径来生产 分子量：65103，是一种非常耐热的依赖于DNA的DNA聚合酶。 （1）作用 具有53DNA聚合酶活性，以单链DNA为模板，以带3自由羟基的DNA片段为引物。 （2）主要用途 对DNA进行测序； 通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)对DNA分子的特定序列进行体外扩增。,5、逆转录酶(依赖于RNA的DNA聚合酶) 来源：一种来自禽成髓细胞瘤病毒(AMV)，分子量为170103； 一种来自能表达克隆化的Moloney鼠白血病病毒(Mo-MLV)逆 转录酶基因的大肠杆菌，分子量为84103。 （1）作用 （2）主要用途 6、末端脱氧核苷酸转移酶(末端转移酶) 来源：小牛胸腺 分子量：60103 （1）作用 （2）主要用途,(三) 依赖于DNA的RNA聚合酶 1、SP6噬菌体RNA聚合酶 来源：SP6噬菌体感染的鼠伤寒沙门氏菌LT2株。 （1）作用 该酶主要具有一种活性，即53 RNA聚合酶活性，识别双链DNA模板上相应的噬菌体特异性启动子，并且以此双链DNA为模板合成RNA。 （2）主要用途 合成单链RNA，制备杂交探针； 合成单链RNA作为体外翻译系统中的功能性mRNA或体外剪接反应的底物。,2、T7或T3噬菌体RNA聚合酶 来源：T7或T3噬菌体感染的大肠杆菌。 （1）作用 该类酶主要具有一种活性，即53 RNA聚合酶活性，识别双链DNA模板上相应的噬菌体特异性的启动子，并以此双链DNA为模板合成RNA。 （2）主要用途 合成单链RNA，制备杂交探针； 合成单链RNA作为体外翻译系统中的功能性mRNA或体外剪接反应的底物； 利用带有T7噬菌体启动子的载体在大肠杆菌和酵母中表达克隆化基因。,(四) 连接酶、激酶及磷酸酶 DNA连接酶(DNA ligase)：是指将两段DNA拼接起来的酶类。在基因工程中，最常见的DNA连接酶为T4噬菌体DNA连接酶。 RNA连接酶(RNAligase)：能使含5磷酸基端及3羟基端的单链RNA(或DNA)共价连接起来。该酶主要用于对RNA进行3 末端标记，即将32P标记的3，5二磷酸单核苷(pNp)加到RNA的3羟基端。,1、T4噬菌体DNA连接酶 来源：T4噬菌体感染的大肠杆菌 分子量：68103 （1）作用 该酶主要具有一种活性，即催化DNA的5磷酸基与3羟基之间形成磷酸二酯键。该酶的核酸底物为黏性末端DNA、平齐末端DNA、带切刻的DNA等。 （2）主要用途 连接带匹配黏性末端的DNA分子。 使平齐末端的双链DNA分子互相连接或与合成接头相连接。这类反应要比黏性末端连接慢得多。,2、T4噬菌体多核苷酸激酶 来源：T4噬菌体感染的大肠杆菌 （1）作用 具有激酶磷酸化活性，催化ATP的广磷酸基转移至DNA或RNA的5末端； 具有3磷酸酶活性，该酶的核酸底物为双链DNA、单链RNA或DNA、DNA切刻或缺口、寡核苷酸等。 （2）主要用途 标记DNA的5端，以供Maxam-Gilbert法测序、S1核酸酶分析以及其他必须使用末端标记DNA操作之需； 对准备用于连接但缺乏5磷酸的DNA或合成接头进行磷酸化。,3、碱性磷酸酶 来源：大肠杆菌及牛小肠 （1）作用 这两种来源的碱性磷酸酶，即细菌碱性磷酸酶(bacteri alalkaline phosphatase，BAP)和牛小肠碱性磷酸酶(calf intestinal alkaline phosphatase，CIP)均具磷酸酶活性，催化去除5磷酸的反应。该酶的底物为单链或双链DNA及RNA、rNTP和dNTP。 （2）主要用途 在用32P 标记5末端前，去除DNA或RNA分子的5磷酸； 去除DNA片段5磷酸，以防自身环化。,（五）核酸酶 1、BAL31核酸酶 来源：埃氏交替单胞菌(Alteromonas espejiana)BAL31。 （1）作用 （2）主要用途 2、S1核酸酶 来源：米曲霉(Aspergillus oryzae) （1）作用 （2）主要用途,3、核糖核酸酶A(RNA酶A) 来源：牛胰脏 （1）作用 该酶主要具