食品分析理论第八章碳水化合物的测定.ppt

第八章 碳水化合物的测定,第一节 概述 一、碳水化合物的重要性 碳水化合物统称为糖类（醣），在各种食品原料，特别是植物性原料中分布十分广泛，它也是食品工业的主要原料和辅助材料，是大多数食品的主要成分之一 。糖的作用是： A、人体主要的能量物质，人热能的6070由它供给 B、构成人体的一种重要物质 C、维护神经系统的功能的、有解毒作用 D、帮助脂肪代谢 E、促进消化，对大肠微生物有积极意义 F、节约蛋白质的作用 G、是食品重要原料、辅助材料，对食品色、香、味、形有大影响,二、碳水化合物的分类,构成糖碳原子数:5碳糖、6碳糖。 官能团：醛糖、酮糖、衍生糖（糖醇、氨基糖）。 还原性：还原糖、非还原糖。 单体的缩合度：单糖、低聚（寡）糖（2-10）、多糖。 消化器官作用：可消化糖、不可消化糖,糖的分类,三、常用测定方法,测定食品中糖类的方法很多 ，主要的可分为以下几类 1、还原法-利用羰基的还原性(斐林氏法、高锰酸钾法、铁氰酸钾法、碘量法等） 2、比色法（银法、糖与浓酸的产物与显色剂缩合反应法） 3、仪器法。（相对密度法、折光法和旋光法，PC、TLC、GC、HPLC、HPCE及联用技术GC/MS、LC/MS/MS、CE/MS/MS） 4、酶法,第二节 游离态糖类测定的前处理,游离态糖类是指单糖和低聚糖总称，测定时，须选择适当的溶剂提取样品，并对提取液进行纯化，排除干扰物质，然后才能测定。 一、糖类的提取 先将样品磨碎浸渍成溶液，用石油醚除去其中的脂类和叶绿素。然后用极性溶剂提取，常用的提取溶剂有以下两种： 1、水：价廉，来源广泛。注意防止糖类被酶水解或微生物的破坏作用，加入氯化汞(HgCl2)或其它重金属盐可避免、减少这个作用。温度不能太高，约4050。否则将提出相当量的淀粉及糊精，拖延下一步测定的过滤时间，或影响到分析结果。 2、乙醇水溶液7585%(vv)：糖类在乙醇水溶液中具有一定的溶解度。当提取液中的乙醇浓度在7075%(vv)以上时，蛋白质及大多数多糖都不能溶解。用7585%乙醇，可避免样品的稀释作用。用这种提取剂可避免糖类被酶、微生物的破坏作用。此法为AOAC推荐的方法。,说明：1、确定合适的取样量分取倍数，快速法测定糖在净化和可能的转化完成后，每升溶液的含糖量为0.53.5mg之间。 2、含高脂肪的样品要脱脂后进行提取。 3、含高淀粉和糊精的样品要用乙醇进行提取。 4、含挥发组分如酒精和二氧化碳的液体样品要先水浴除去挥发组分。 二、干扰消除 极性溶剂提取液除含有单糖和低聚糖等可溶性糖类外，还含有影响测定的杂质，如：色素、蛋白质、可溶性果胶、可溶性淀粉、有机酸、氨基酸、单宁等， 可使提取液带有颜色、浑浊，影响测定终点的观察、计量的化学反应；胶态杂质的存在还会给过滤操作带来困难，通常加入澄清剂。 1理想澄清剂要求： 能较完全地除去干扰物质 不吸附或沉淀被测糖分，也不改变被测糖分的理、化性质 过剩的澄清剂应不干扰后面的分析操作，或易于除掉 澄清剂的种类很多，在糖类分析中较常用的有以下三种：,2、常用澄清剂 中性醋酸铅 Pb(CH3COO)23H2O：最常用澄清剂。铅离子能与很多离子结合，生成难溶沉淀物，同时吸附除去部分杂质。它能除去蛋白质、果胶、有机酸、单宁等杂质。 它的作用较可靠，不会沉淀样液中的还原糖，在室温下也不会形成铅糖化合物，因而适用于测定还原糖样液的澄清。但它的脱色能力较差，不能用于深色样液的澄清。 乙酸锌和亚铁氰化钾：利用乙酸锌Zn(CH3COO)22H2O与亚铁氰化钾反应生成的氰亚铁酸锌沉淀来挟走或吸附干扰物质。这种澄清剂除蛋白质能力强，但脱色能力差，适用于色泽较浅，蛋白质含量较高的样液的澄清，如乳：制品、豆制品等。,硫酸亚铜和氢氧化钠：这种澄清剂是由硫酸亚铜溶液和氢氧化钠溶液组成，在碱性条件下，铜离子可使蛋白质沉淀，适合于富含蛋白质的样品的澄清，脱色能力强。 碱性醋酸铅、氢氧化铝溶液、活性炭等也可作为澄清剂。但碱性醋酸铅能沉淀还原糖；氢氧化铝溶液澄清效果差，只能除去胶态杂质；活性炭能吸附糖类造成糖的损失。详细见P114 2澄清剂的用量 澄清剂的用量必须适当。用量太少，固然达不到澄清的目的，用量太多则会使分析结果产生误差。 应使用最少量的澄清剂，也可加入除铅剂来避免铅糖的产生。常见的除铅剂有草酸钾，草酸钠，硫酸钠，磷酸氢二钠等。,第三节 单糖和低聚糖的测定,一、还原糖的测定方法 还原糖的测定方法很多，其中最常用的有直接滴定法、高锰酸钾滴定法、萨氏法、碘量法等。 测定反应通式：还原糖 + 氧化剂 糖氧化物（糖酸） 测定范围：可直接测定糖有葡萄糖、果糖、乳糖和麦芽糖它们又称还原糖。通过水解生成相应的还原性单糖来测定糖双糖(如蔗糖)、三糖乃至多糖(如糊精、淀粉等) 。 方法分类：按所使用氧化剂，可分为铁法、铜法、碘量法。氧化剂的氧化能力Fe 3+Cu 2+ I2 （一）铜法 根据操作方式和定量对象不同，可以细分以下几种方式 1、兰艾农(LaneEynon)法（四甲基蓝法） 兰艾农法是国际上常用的定量糖的方法，广泛应用于科研、生产中糖的定量。,（1）原理：将一定量的费林试剂甲、乙液等量混合，生成深蓝色的可溶性酒石酸钾钠铜配合物。 在加热条件下，以次甲基蓝作为指示剂，用样液滴定费林试剂混合液，样液中的还原糖与酒石酸钾钠铜反应， 待二价铜全部被还原后，稍过量的还原糖把次甲基蓝还原，溶液由蓝色变为无色，即为滴定终点。 根据样液消耗量可计算出还原糖含量。各步反应式(以葡萄糖为例)如下： CuSO42NaOH = 2Cu(OH)2Na2SO4,（2）测定说明 A、费林试剂： 费林甲液：称取69.278克结晶硫酸铜(CuSO4.5H2O)，用水溶解后，定容1000毫升。 费林乙液：称取346克酒石酸钾钠(NaKC4H4O5.4H2O)溶于约500毫升水中；另称取氢氧化钠100克溶于约200毫升水中。将二者混合，定容1000毫升。 B、滴定不离开热源，保持沸腾。让上升的蒸汽阻止空气侵入溶液中。防止无色的四甲基蓝与空气中的氧结合，又变为蓝色。 C、测定还原糖时，应严格遵照所规定的条件，主要控制pH值（酒石酸钾钠氢氧化钠） 、加热温度（保持沸腾）和时间（控制3分钟，通过预备滴定、正式滴定来实现） ；并根据指定的还原糖分检索表进行计算。,从还原糖与费林试剂作用的反应式， 1分子葡萄糖可以将6个Cu2+还原为Cu+。但一般说来，1分子葡萄糖只能将5个多Cu2+还原，而且随条件而改变。因此，不能根据上述反应式直接计算出还原糖量，而是用实验方法制出还原糖检索表，P335337。 果糖能不能与费林试剂？ 能。 果糖与葡萄糖和费林试剂作用，那一个速度更快？ 葡萄糖是醛糖，果糖是酮糖，还原性：醛基酮基，葡萄糖更快？ 事实上是果糖速度更快。 果糖在碱性溶液的差向异构体中烯醇中间体的比例较葡萄糖高，它与Cu2+反应速度最快,作业四： 1、简述食品分析常用的酸度，它们 的测定意义和测定方法。 2、简述脂肪常用提取剂的特点?简述脂肪常用分析方法的原理及特点? 3、简述糖的分类及常用提取剂、澄清剂的特点?就大类来说糖的测定常用的有那些方法？,（3）测定方法,A、费林试剂标定（确定校正系数Kf） a .预备滴定（预检、粗滴定 ） 用吸量管分别吸取费林甲液和乙液各5.00毫升，注入250毫升锥瓶中从滴定管加入0.2%标准的葡萄糖液23毫升将锥瓶放在石棉铁丝网上，用电炉或酒精灯加热使溶液沸腾，并准确控制煮沸2分钟，加入四甲基蓝指示剂3滴，在糖液保持沸腾情况下，从滴定管以3秒/滴的速度滴加0.2%标准的葡萄糖液，至四甲基蓝的蓝色刚刚消失为止，即为终点。记下用去配制糖液毫升数(包括预先放入的23毫升标准的葡萄糖液)。 预备滴定作用：了解滴定的大概数量，以便准确控制正式滴定的时间； 对于样品，还可确定稀释倍数是否恰当，50毫升V15毫升，否则无法查表计算。,b.正式滴定（复检、精密滴定 ）,同样分别吸取费林甲液和乙液各5.00毫升，注入250毫升锥瓶中，从滴定管加入标准的葡萄糖液，其量比预检时所耗用的配制糖液少约1毫升(例如，预检时用去标准的葡萄糖液24毫升，此时，则预量为23毫升)，将锥瓶置于电炉使溶液沸腾，其沸腾时间为2分钟，加入四甲基蓝指示剂3滴，继续从滴定管中加入糖液，至四甲基蓝的蓝色刚刚消失为止。此项续加工作，亦不可超过1分钟，V = 60/20 = 3 d/s 记录耗用配制糖液毫升数。 操作（flash） 若正式滴定的体积为24.91毫升，则此费林试剂的浓度为1N，此为人为规定。 否则要校正，其校正系数Kf = V实际 24.91 ， Kf 1 表示Cu2+ 不足， Kf 1表示Cu2+ 过量。 不同 的糖Kf不同， 对转化糖（蔗糖的水解产物，1分子葡萄糖和1分子果糖混合物）来说，校正系数为Kf = V实际 25.64 ，,费剂 预滴 公式 例题 说明,B、样品测定,将前面费林试剂标定过程中的标准的葡萄糖液换成处理好的样品溶液进行类似的操作过程预备滴定、正式滴定，然后查表计算 计算式：,式中：Kf：是费林试剂浓度校正因子。 f：是还原糖因素，（一定的费林试剂相当还原糖的量，不同的糖查不同的表）。由U查P335-337的表得出；（mg）。 U:是处理好的样品溶液滴定费林试剂所耗用的体积；（mL）。 V:处理好的样品定容的体积；（mL） 。 n:稀释(分取)倍数。,例：称5.000g样品，预处理好后定容250mL，用兰艾农法法测定还原糖（未说明一般指葡萄糖），标定费林试剂耗用标准的葡萄糖液24.30mL（费林试剂标定后可用一周），滴定消耗样品定容液的平均值32. 50mL，求样品中葡萄糖的含量？（未说明一般指费林试剂A、B各取5.00mL） 解：依题意，根据兰艾农法法测定还原糖的计算公式,Kf = V实际 24.91 = 24.30 24.91 = 0.975 查表 P 336附 表 9，当 U = 32.5，f = 50.25 (f:32、33 的平均值),答：样品中葡萄糖的含量为7.54%。,C、说明,a.查表 P 336附 表 9可知，在滴定费林试剂A、B各取5.00mL的过程中， 100mL葡萄糖溶液含有200mg葡萄糖。则对应的滴定体积为24.91mL，因此规定0.2%标准的葡萄糖液滴定费林试剂体积为24.91mL时，此费林试剂浓度为1N。 b.影响测定结果的主要操作因素是反应液碱度，热源强度、煮沸时间和滴定速度。 c.蔗糖是葡萄糖和果糖组成的双糖，没有还原性，不能用碱性铜盐试剂直接测定，但在一定条件下，可将蔗糖水解为具有还原性的转化糖即葡萄糖和果糖混合物。因此，可以先测定转化糖含量。再乘以一个换算系数0.95=1水分子量(18)葡萄糖分子量(180)+果糖分子量(180)即为蔗糖含量。0.95 转化糖换算为蔗糖的系数。,D、方法特点,适用于还原糖含量较高的样品。在我国，兰艾农法是甘蔗糖厂测定还原糖的统一方法。 这种方法迅速简便，对于熟练的工作人员来说，其分析结果的重现性也很好。方法误差为0.5%。 这种方法不足：计算要查表，操作有难度，要求熟练，经验性强；影响测定因素多，终点不太好观察，还原糖分含量低(在0.8以下),颜色太深，终点难以判断样品不能用此法。,2、直接滴定法(快速改良法) GB/T5009.7-1985中第二法,（1）适用范围及特点 其特点是试剂用量少，操作和计算都比较简便、快速，滴定终点明显，适用于各类食品中还原糖的测定。但测定酱油、深色果汁等样品时，因色素干扰，滴定终点常常模糊不清，影响准确性。本法是国家标准分析方法。 （2）改良费林试剂 A、硫酸铜甲液：称取15g硫酸铜(CuSO45H2O)及005g次甲基蓝，溶于水中并稀释到1000ml。 B、碱性酒石酸钾钠乙液：称取50g酒石酸钾钠及75g氢氧化钠，溶于水中，再加入4g亚铁氰化钾，完全溶解后，用水稀释至1000ml，贮存于橡皮塞玻璃瓶中。,（3）方法原理,它是在蓝一埃农容量法基础上发展起来的，基本原理大体上相同，主要作了以下的改良： A、降低费林试剂的浓度，使浓度效应、生成沉淀的可能性减少。 B、在费林试剂乙液-碱性酒石酸钾钠加入K4Fe(CN) 6 加，改善终点颜色，它所起的反应： Cu2O + K4Fe(CN) 6 K2Cu2 Fe(CN) 6 + 2KOH 红色沉淀 淡黄色溶液 终点颜色由浅兰色、红色沉淀淡黄色、近无色溶液，使终点变色更敏锐。 C、改变滴定方式，用返滴定方式测定样品，计算不用查表。,（4）操作要点,A、取改良费林试剂甲、乙液各5.00 mL，用0.1%葡萄糖进行滴定，操作要求同在蓝一埃农（要求准确控制测定的pH,，温度，滴定时间,同样要求做预滴定、准确滴定）；滴定用0.1%葡萄糖体积为G。 B、取改良费林试剂甲、乙液各5.00 mL，准确加入5.00 mL的处理好的样品溶液（保证不过终点，否则进行稀释，或减少加样量），蓝一埃农操作要求，用0.1%葡萄糖进行滴定，到终点；滴定用0.1%葡萄糖体积为D。 （5）计算式：,G:用0.1%葡萄糖滴定费林试剂体积；mL； D :用0.1%葡萄糖滴定加样液费林试剂体积；mL； C：标准葡萄糖溶液浓度0.1%； n：样品的稀释倍数； W：称、量样量，g(mL)； V：样品预处理好后，定容体积， mL； 0.95：转化糖换算成蔗糖系数。,3、姆松华尔格法（重量法）,（1）方法特点：方法分析所得的结果准确，重现性好，操作简单，但花费时间较多。 （2）方法原理： 将样品试液与过量的费林氏试液反应，产生一定量的Cu2O，将它过滤、洗涤、干燥，称量Cu2O的重量，将W Cu2O WCu （ WCu = W Cu2O 63.57 2143.14 ），从指定的检索表查得与铜量相当的糖量，见P338342附表9 ，再计算样品的含糖量。,式中： s：是铜量还原糖因素，由过滤、洗涤、干燥，称量Cu2O的重量，换算后查P338342附表9的表得出；（mg）。 V1 :是测定移取处理好的样品溶液的体积；（mL）。 V0 :处理好的样品定容的体积；（mL） 。 n:稀释(分取)倍数。,重量法,KMnO4,夏富安,3、高锰酸钾法（重量改良法、贝尔德蓝德法 Bertrand）,（1）原理：将样品试液与过量的费林氏试剂反应，产生一定量的Cu2O，将它过滤、洗涤、干燥，加入过量的酸性硫酸铁溶液将其氧化溶解，而三价铁盐被定量地还原为亚铁盐，用高锰酸钾标准溶液滴定所生成的亚铁盐，根据高锰酸钾溶液消耗量可计算出铜的量，从检索表中查出与铜量相当的还原糖量，计算出样品中还原糖含量，计算式与重量法相同。费林氏试剂与还原糖反应与蓝一埃农法相同，其它的各步反应式如下。 Cu2+还原糖Cu2O Cu2O + Fe2(S04 )3 + H2SO4 = 2CuSO4 + 2FeS04 + H2O 10FeSO4+2KMnO4+8H2SO4= Fe2(SO4)3+K2SO4+2MnSO4+8H2O 综合这两个反应式可见： Cu2O + 2KMnO4 = 2Mn 2+ + 10Cu2+ 即：5摩尔Cu2O相当干2摩尔KMnO4，根据高锰酸钾标准溶液的消耗量可计算出铜量，查检索表得出相当还原糖量。 （ 2）方法特点：本法是国家标准分析方法，适用于各类食品中还原糖的测定，有色样液也不受限制。方法的准确度高，重视性好，准确度和重现性都优于直接滴定法。但操作复杂、费时，需使用特制的铜量相当的还原糖量检索表。,4、夏富安哈脱曼法（Shaffen-Hartman）,（1）方法特点：与贝尔德蓝德法类似，但是氧化Cu2O采用中等强度的氧化剂碘， Cu2O不用过滤，使测定操作更加简便快速。 （2）原理：将样品试液与过量的费林氏试剂反应，产生一定量的Cu2O，用稀硫酸它溶解，加入一定量但保证过量的碘溶液将其完全氧化，用硫代硫酸钠确定碘在此过程的消耗量，据此可计算出铜的量，从检索表中查出与铜量相当的还原糖量，计算出样品中还原糖含量，计算式与重量法相同。费林氏试剂与还原糖反应与蓝一埃农法相同，其它的各步反应式如下。 Cu2+还原糖Cu2O KIO3+5KI+3H2SO43K2SO4+3H2O3I2 Cu2O + H2SO4 = Cu2SO4 + H2O Cu2SO4 + I2 2CuSO4 + CuI2 此反应可逆，加草酸盐与Cu+2形成络合物可促使向右进行。 I2 2Na 2S2O3 Na2S4O6+2NaI,5、萨氏(Somogyi 索模吉)法,（1）原理：反应式与夏富安哈脱曼法相同，原理相似，将样液与过量的碱性较低含有大量的Na2SO4碱性铜盐溶液共热。样液中的还原糖定量地将二价铜还原为氧化亚铜，生成的氧化亚铜在酸性条件下溶解，并定量地消耗碘化钾与碘酸钾在酸性条件下反应生成的一定量的游离碘。剩余的碘用硫代硫酸钠标准溶液滴定，同时做空白试验，根据硫代硫酸钠标准溶液消耗量可求出与一价铜反应的碘量，据此可计算出铜的量，从检索表中查出与铜量相当的还原糖量，计算出样品中还原糖含量，计算式、化学反应式与重量法相同。 （2）方法特点：微量法，检出量0.0153mg。灵敏度高。重现性好, 结果准确可靠。样液用量少，可用于生物材料或经过层析处理后的微量样品测定。终点清晰，有色样液不受限制。 （3）试剂： 萨氏试剂：71 g Na2HPO412H2 0.40 g 酒石酸钾钠溶于约400 ml水中。加入1 molL NaOH 溶液 100 ml。把8 gCuSO45H20 溶于水并稀释到80ml，边搅拌边加入到上述溶液中。再取 410 g Na2SO410H20 溶于水中，加入到上述溶液中，再加入(16) molL KIO3 溶液25 ml 加水稀释到 1000 ml。放置数天后，用微孔玻璃漏斗过滤，备用。,（4）萨氏试剂说明,萨氏试剂主要由硫酸铜磷酸盐酒石酸盐组成，它特点： A、萨氏试剂中加入大量的Na2SO4的作用是降低反应液中的溶解氧，避免生成的Cu2O重新氧化，增加铜试剂的灵敏度。 B、用Na2HPO4代替部分NaOH，使试剂碱性较弱。因此不必配成甲、乙液，配成混合溶液也可保存较长时间。另外，试剂碱度低时，还原糖的还原当量高，可提高测定的灵敏度。 若具有足够的反应时间，铜试剂的碱度愈低，还原糖的 还原当量愈高，反应彻底性愈高，测定的灵敏度愈高。因此，在测量微量还原糖时，铜试剂碱度宜低些。 可是，碱度降低，还原糖的氧化速度变慢，因而会延长测定时间，干扰因素增加。特别是在测定氧化速度比葡萄糖慢的还原糖(如麦芽糖、木糖、甘露糖)时反应时间长，增加测定误差，因此测定碱度也不宜过低。,6、其它铜法测定还原糖方法,A、奥夫奈尔(Ofner)法 (1)奥夫奈尔试剂：称取硫酸铜(CuSO4.5H20)5克，酒石酸钾钠300克，碳酸钠10克及磷酸氢二钠50克溶于900毫升冷水中，溶液在沸腾水浴中加热杀菌2小时，冷却后稀释成1000毫升，加入少量活性炭或精制硅藻土过滤，过滤后，将滤液贮于有色试剂瓶中。 (2)原理：用奥夫奈尔试剂的碱性铜盐溶液作为氧化剂，用Na2CO3及Na2HPO4代替费林溶液中的NaOH，碱性较弱，可将铜盐与酒石酸钾钠等混合配成溶液，长时间保存，还原糖与铜盐的氧化还原过程进行得较慢，但蔗糖被氧化的份量也大为减少，测定的结果比较准确。定量方式与夏富安哈脱曼法类似， Cu2O用盐酸溶解，然后用碘滴定法定量所生成的Cu2O，据此可计算出铜的量，从检索表中查出与铜量相当的还原糖量，从而确定样品的还原糖分。主要的反应式如下： Cu2+还原糖Cu2O KIO3+5KI+3H2SO43K2SO4+3H2O3I2 Cu2O + 2HCl = Cu2Cl2 + H2O Cu2Cl2 + I2 2CuCl+ CuI2 此反应可逆，加草酸盐与Cu+2形成络合物可促使向右进行。 I2 2Na 2S2O3 Na2S4O6+2NaI,B、克奈特阿连(KninghtAllen)法,（1）方法特点：方法本法是一种络合滴定法适用于还原糖含量低(0.0010.02%)的样品。简便，准确，ICUMSA已采纳它作为测定精糖中还原糖分的一种试行方法。 （2）原理：在样液中加入一定量碱性铜试剂，还原糖将其中相当量的Cu2+还原成Cu2O沉淀，再用EDTA标准溶液将过剩的Cu2+反滴定，用紫脲酸铵指示，配合滴定反应如下： Cu2+ 还原糖 Cu2O Cu2+ +H2Y2- =CuY2- +2H+ 根据消耗的EDTA标准溶液量，可间接算出样液中还原糖的含量。溶液中存在的Cu2O 沉淀，对测定结果没有影响。 (3)碱性铜试剂 ：取40毫升1NNaOH加入约600毫升蒸馏水中，加入25克碳酸钠和25克酒石酸钾钠，摇匀，使全部溶解，将6.000克硫酸铜(CuSO45H2O)溶解于约100毫升蒸馏水中，将此溶液和上述碱性酒石酸钾钠溶液一并移入1000毫升容量瓶中，然后，加蒸馏水至标线。,（二）铁氰化钾法（Hames、汉斯） GB/T 5513-1985,1、方法原理：样品还原糖在碱性溶液中能将高铁氰化钾还原，根据铁氰化钾的浓度和检液滴定量可计算出含糖量。其反应式如下； C6H12O6 +6K3Fe(CN) 6+6KOH (CHOH) 4(COOH) 2+6K4Fe(CN) 6十4H20 滴定到终点时，稍微过量还原糖使指示剂次甲基蓝由蓝色还原为无色的隐色体。 2、方法特点：与铜法比较，Fe的氧化性要强一些，除氧化还原外，还能氧化其它的一些还原物质，测定的结果偏高。测定条件要求低一些，可利用反应式计算，不用查表。,（三）碘量法 （Willstarter-Schudel 威尔斯塔脱-舒特）,1原理：样品经处理后，取一定量样液于碘量瓶中，加入一定量过量的碘液和过量的氢氧化钠溶液，样液中的醛糖在碱性条件下被碘氧化为醛糖酸: I22NaOH=NaIONaIH2O CH2OH(CHOH)4CHO NaIO NaOH= CH2OH( CHOH)4 COONa NaIH2O 总反应式：CH2OH(CHOH)4CHO I2 3NaOH = CH2OH( CHOH)4 COONa 2NaI2H2O 然后加入盐酸使反应液呈酸性时，析出碘： NaIONaI2HCl=2NaCl H2O I2 用硫代硫酸钠标准溶液滴定析出的碘，则可计算出氧化醛糖消耗的碘量，从而计算出样液中醛糖的含量。 在一定范围内，上述反应是完全按化学反应式定量进行的，因此可以利用化学反应式进行定量计算。从反应式可计算出1 mmol碘相当于葡萄糖180 mg；麦芽糖342 mg；乳糖360 mg。,3、方法特点,本法用于醛糖和酮糖共存时单独测定醛糖，与蓝一埃农法联用，可将样品中的总糖，醛糖，酮糖量一一测定出来。适用于各类食品，如硬糖、异构糖、果汁等样品中葡萄糖的测定。 4、计算式：,V0：滴定空白碘液耗用硫代硫酸钠标准溶液体积；mL； V1：滴定加了样品碘液耗用硫代硫酸钠标准溶液体积；mL； C：硫代硫酸钠标准溶液标准葡萄糖溶液浓度；mol/L； W：称、量样量，g(mL)； M:计量糖的mol质量； n：样品稀释倍数。,二、比色法,（一）3，5二硝基水杨酸比色法 1、原理：在氢氧化钠和丙三醇存在下，还原糖能将3，5二硝基水杨酸中的硝基还原为氨基，生成氨基化合物。此化合物在过量的氢氧化钠碱性溶液中呈桔红色，在540nm波长处有最大吸收，其吸光度与还原糖含量有线性关系。 2、特点：此法适用于各类食品中还原糖的测定，具有准确度高、重现性好、操作简便、快速等优点，此法的相对误差为2.2，尤其适用于大批样品的测定。 3、试剂：3，5二硝基水杨酸溶液：称取6.5g 3，5二硝基水杨酸溶于少量水中，移入1000ml容量瓶中，加入2molL氢氧化钠溶液325ml，再加入45g丙三醇，摇匀，冷却后定容到1000ml。 4、测定：吸取样液1.0mL(含糖34mg)，置于25mL容量瓶中，各加入3，5二硝基水杨酸溶液2mL，置于沸水浴中煮2min，进行显色，然后以流水迅速冷却，用水定容至25mL，摇匀。以试剂空白调零，在540nm处测定吸光度，与葡萄糖标样作对照，求出样品中还原糖含量。,（二）斐林试剂比色法,1、原理特点：含有醛基或酮基的单糖和多糖的水解产物，在碱性条件下煮 沸能使斐林试剂中的二价铜离子还原为一价的氧化亚铜，而使蓝色的斐林试剂脱色，脱色的程度与溶液中含糖量成正比。 本法在100500mgL还原糖范围内呈良好的线性关系。 2、试剂：(1)斐林试剂甲：40g硫酸铜溶于蒸馏水并定容至1000mL。 (2)斐林试剂乙：200g酒石酸钾钠与150g氢氧化钠溶于蒸馏水并定容至1 000mL。 (3)0.1葡萄糖标准液；取10512干燥2 h的恒重的葡萄糖0.1g，加蒸馏水溶解并定容至l00mL。 3、测定：(1)标准曲线绘制；在各试管中分别加入0.1葡萄糖标准液0、1、2、3、4、5、6mL并分别加蒸馏水补足至6mL，在各管中加入4mL斐林试剂甲、乙混合液，混匀，在试管口用玻璃球盖好，放入沸水浴加热15min，取出后在流水中冷却，再以1500rmin离心5min，取上清液在590nm波长处进行比色测定，以蒸馏水调零，读取各管吸光值。然后把空白管的吸光值减去各管不同浓度糖的吸光度值，并以此差值作纵坐标，各相对的糖含量作横坐标，绘制标准曲线。 (2)样品测定，吸取6.0mL待测样品溶液(适当稀释至约含500mgL还原糖)，加4mL斐林试剂混合液，并和标准曲线同样操作，在590nm波长处测出吸光度。据不含样品的空白管吸光值减去样品测得的吸光度值，在标准曲线上查得糖含量，并乘以样品稀释倍数，计算出单位体积或质量样品中的含糖体积分数或质量分数()。,（三）缩合比色法,单糖与强酸加热产生糠醛或糠醛衍生物，然后通过显色剂缩合成有色络合物，再进行比色定量。与酸反应，戊糖和甲基戊糖的反应产物是2糠醛和2甲基糠醛。己糖与酸反应后初始产物是5羟甲基糠醛2，该产物不稳定，反应在浓盐酸中进行时，可继续缩合或与卤素起取代反应。果糖的反应产物除5羟甲基糠醛2外，还有2羟乙酰基呋喃。 常用的显色剂有酚类、芳香族胺等。发色反应的机理迄今尚未了解，因而进行定量分析时的操作条件有它的经验性，但当调整不同的实验条件时，可改变分析方法的选择性。 P161表8-10(无锡轻大编)列一些缩合反应法测定糖类的实验条件,下面简要介绍几个常用有代表性的缩合比色方法。,A、蒽酮比色法,1原理：单糖类遇浓硫酸时，脱水生成糠醛衍生物，它与蒽酮缩合成蓝绿色的化合物，当糖的量在20一200mg/L范围内时，其呈色强度与溶液中糖的含量成正比，可比色定量分析。反应式(以葡萄糖为例)见P130 单糖、双糖、糊精、淀粉等糖类都可直接与试剂发生反应，如果结果中不包含糊精、淀粉，则预先将它们除去。 2、特点：该法是微量法，适合于含微量碳水化合物的样品，测定范围20一200mg/L；具有灵敏度高、试剂用量少等优点。 乙醇 对测定的干扰不大，可做多种糖的同时测定，反应简单快速。本法反应条件控制较严，如反应温度、显色时间、试剂和溶液的初始温度，这些因素都将影响显色状况，操作稍不留心，都会引起误差。,B、酚硫酸比色法,1、原理：糖类物质与硫酸作用脱水，生成糠醛或糠醛的衍生物，此衍生物遇芳香族酚类，综合生成有色物质，然后再进行比色定量。 2、样品测定：吸取样品稀释液lmL，加入lmL 5酚水溶液，再加入5mL浓硫酸，摇匀。10min后，放入25-C水浴中20min，以试剂空白调零，在490nm波长下测定其吸光值，与标样作对照求出样品中糖含量。 3、说明：(1)此法简便又稳定，是一个高灵敏度的分析方法，最低检出量为l0 g。但由于强酸可水解多糖和糖苷，应避免这方面的干扰。 (2)由于不同的糖类可以得到不同的色泽，可制成对应的各类糖的标准曲线，借此测定样品中的糖。六碳糖及其甲基化衍生物，在490nm下比色测定；五碳糖、糖醛酸及其甲基衍生物，在480nm下比色测定。,C、半胱氨酸一咔唑法,(1)原理：单糖与强酸反应生成糠醛或其衍生物，再与显色剂半胱氨酸及咔唑缩合成有色络合物，此络合物在560nm处有最大吸收可以比色测定。 (2)适用范围及特点:本法是微量法，适用于葡萄糖和果糖共存时果糖的测定。半胱氨酸和咔唑可与所有糖类反应，但果糖发色程度远远超过葡萄糖(葡萄糖：果糖=1：280)，即使葡萄糖含量高于果糖1倍，对测定结果影响也不大， 蔗糖在此测定条件下会水解，增加果糖含量，故此法不能用于有蔗糖共存的样品的测定。,三、仪器法,简单的有物理方法，这种方法是应用物理性质(如比重，折射率，比旋光度等)来简便快速地测试一些液态食品中糖的浓度。 较准确常用的有PC、TLC、GC、HPLC、HPCE。 高、新、尖的有联用技术GC/MS、LC/MS/MS、CE/MS/MS）。 本课程介绍简明实用的PC法,（一）纸上层析法（PC 实质是一种色谱方法）,方法提要:色谱法是一种物理的分析方法，利用混合物中各组分物理化学性质的差别(如吸附力，分子亲合力，分配系数等)，使各组分以不同速度移动而达到分离。 纸上层析法应用于糖类的分离分析，由于其设备十分简单、价廉，可进行分离、定性与定量，已成为一项很有效的分析技术。 操作：点样、展开、干燥、显色、测定（定性和定量） PC法固定相：滤纸纤维及其结合水（或溶剂）所形成的复合物； 流动相(通常称展开剂)：一种有机溶剂或多种溶剂加水混合液； 当样品沿滤纸随流动相通过固定相时，由于各种糖理化性质不同，各组分分配系数的有差别，在两相中扩散速度不同，从而使各组分以不同速度移动，结果彼此可以分离。 PC法用于定性分析的参数是比移值Rf:被测物质在滤纸上移动的速率。,Rf值最大等于1 ，最小等于0。 Rf值是衡量各组分的分离情况的数值， Rf值相差越大，分离效果越好。,1、影响Rf的因素,由于影响Rf值的因素很多，实验数据往往与文献记载不完全相同，因此，在鉴定时常常采用标准样品对照。 几种糖的Rf，值见左上表。 一般说来，糖类的Rf值依次为单糖二糖三糖，戊糖己糖 在己糖中，酮糖醛糖。 二糖的Rf值中1，4键结合的要比1，6键结合的大一些，而-D葡萄糖苷的二糖则较-D-葡萄糖苷的二糖要大一些,内因：被测定物质结构。 外因：固定相、流动相、温度等。 当外因即温度，滤纸等实验条件确定时，比移值就是一个特有的常数，因而可作定性分析的依据。,2、 展开剂与显色剂,A、 展开剂：展开剂常用三元系统溶剂 a.对被分离物质糖溶解度小的物质，如正丁醇、乙酸乙酯、丙酮、丙醇。 b.对被分离物质糖溶解度大的物质，如水、乙醇。 c.用于调节各组分的比例或调节系统pH值物质，酚、吡啶、醋酸。 展开剂含物质a越多，对被分离物质糖动力小，Rf越小。 反之，展开剂含物质b越多，对被分离物质糖动力大，Rf越大。 物质c对Rf有微调作用，物质c极性越大，对被分离物质糖动力大，Rf越大。 常用展开剂组成见P169表812,B、显色剂,显色剂按其作用原理可分为两类 (1)糖使显色剂还原生成一有色衍生物，银盐显色剂，灵敏度高，但试剂中有大量水分，使斑点容易扩散，它对还原糖显色。对醛糖非常灵敏，但对果糖反应较弱。它可与许多化合物反应，如有Cl-离子，就会干扰测定。 (2)糖与酸及酚，或芳胺受热发生缩合反应 a.邻苯二甲酸苯胺:灵敏度比银盐显色剂略低些，对酮糖显色不灵敏。对棉于糖、蔗糖不显色。对糖有特异性，且不受其他杂质干扰。 b.二苯胺:对各种类型的醛糖、酮糖都能显色，但灵敏度稍差。 c.对甲氧基苯胺:可用来测定许多糖，对果糖灵敏度较高。 d.萘酚：这类试剂对果糖、蔗糖、棉子糖反应灵敏。其他酚酸试剂，如萘骈间苯二酚，也可用于蔗糖，棉子糖等非还原糖的显色。,3、展开方式,(1)下行法：展开速度快、适用于易分离的组分分离，将供试品溶解于适当的溶剂中制成一定浓度的溶液。用微量吸管或微量注射器吸取溶液，点于点样基线上，溶液宜分次点加，每次点加后，自然干燥、低温烘干或经温热气流吹干，样点直径为24mm，点间距离约为1.52.0cm，样点通常应为圆形。 添加展开剂使浸没溶剂槽内的滤纸，展开剂即经毛细管作用沿滤纸移动进行展开，展开至规定的距离后，取出滤纸，标明展开剂前沿位置，待展开剂挥散后按规定方法检出色谱斑点。 (2)上行法：展开速度慢、容易达到平衡，分离效果好，点样方法同下行法。展开室内加入展开剂适量，放置俟展开剂蒸气饱和后，再下降悬钩，使色谱滤纸浸入展开剂约0.5cm,展开剂即经毛细管作用沿色谱滤纸上升，除另有规定外，一般展开至约15cm后，取出晾干，按规定方法检视。 （3）双向法：适用于难分离的混合物的分离；展开可以向一个方向进行，即单向展开；也可进行双向展开,即先向一个方向展开,取出，俟展开剂完全挥发后，将滤纸转动90,再用原展开剂或另一种展开剂进行展开;亦可多次展开、连续展开. (4)径向展开（辐射法)，用于探索分析,展开剂从滤纸中心渗入，样品点在以滤纸中心为圆心的圆周上，随着展开剂的展开,样品以辐射的方式向四周展开。,4、滤纸,质地均匀平整，具有一定机械强度，不含影响展开效果的杂质；也不应与所用显色剂起作用，以致影响分离和鉴别效果，必要时可进行处理后再用。 用于下行法时，取色谱滤纸按纤维长丝方向切成适当大小的纸条，离纸条上端适当的距离（使色谱纸上端能足够浸入溶剂槽内的展开剂中，并使点样基线能在溶剂槽侧的玻璃支持棒下数厘米处）用铅笔划一点样基线，必要时，可在色谱滤纸下端切成锯齿形便于展开剂滴下。 用于上行法时，色谱滤纸长约25cm，宽度则按需要而定，必要时可将色谱滤纸卷成筒形；点样基线距底边约2.5cm。,5、样品的预处理,与前面介绍的糖测定的预处理类似， 抽提澄清除盐。 6、定性分析 求样品各成分的Rf值，与标准样品比较，可确定样品中糖的种类。 7、定量分析 直接法：直接在滤纸上测定，用斑点光密度、斑点面积或将两者综合进行定量。 间接法：将斑点用溶剂洗脱后配合其他方法进行测定。如比色法或其它高档仪器法。,（二）薄层层析法,原理：将吸附剂均匀地铺在玻璃板上，点上欲分离的样品，然后用合适的溶剂展开。根据吸附剂对各种糖类物质吸附能力的强弱不同，在吸附剂和展开剂中吸附和解吸的差异，使样品中各物质以不同的速度移动，最后达到分离。根据Rf值可进行定性 对已分开的斑点显色，而将与它位置相当的另一个未显色的斑点从薄层上与硅胶G一起刮下，以适当溶剂将糖从硅胶G上洗脱下来，再用糖的定量测定法测出各组分的含量。 糖在硅胶G薄层上的移动速度与糖的分子量和羟基数有关。经过合适的溶剂展开后，糖在薄板上的移动速度是戊糖己糖双糖三糖。,（三）气相色谱法,原理：样品经处理后，进行衍生使之生成挥发性TMS（三甲基糖）衍生物，然后 注入色谱仪中，在一定的色谱条件下进行分离，得出色谱图，再与标准糖色谱图比较，用保留时间定性，峰高或峰面积定量。 本法适用于果汁、果酱、饼干、糕点等加工食品以及水果、蔬菜不适宜用于含乳糖的乳制品。 试剂衍生六甲基二硅胺烷(HMDS)。 芘：作内标物用。 气相色谱仪：附火焰电离检测器。,（四）高效液相色谱法,1原理：样品经适当前处理后，将糖类的水溶液注入反相化学健合相色谱体系，用乙腈和水作为流动相，糖类分子按其分子量由小到大的顺序流出，经差示折光检测器检测，与标样糖色谱图比较，用保留时间定性，峰高或峰面积定量。 本法的处理操作适用于乳及乳制品。对不同的食品分别采取适当的样品处理方法，根据待测糖的种类，改变流动相乙腈溶液的浓度，可扩大适用范围。 (2)色谱分离条件 色谱柱： Bondapak Carbohydrate (4mmx300mm)。 流动相：乙腈+水 (80+20)。 流速：2.5mLmin。 进样量：20 L。 检测器：401型，4X。 温度：室温。,四、酶法,利用酶的高效、专一的特点，能解决复杂的分析问题，即当分析混杂有多种同类的物质时，尚能测定出其中某一物质而不受干扰，这种分析技术称为酶法。 常见的酶法如用葡萄糖氧化酶测定葡萄糖,如医学上葡萄糖测定试剂盒利用的是葡萄糖氧化酶法。 这是一种颇有潜力的分析方法，但由于存在酶源稳定性差，纯度和比活力较低，结果的重现性差的问题，所以，这种分析技术的应用受到一定的限制。 葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖 方法提要 本法利用葡萄糖氧化酶专一地催化葡萄糖，它能促使葡萄糖氧比成葡萄糖酸，同时产生等当量的过氧化氢。再在过氧化物酶的作用下，利用产生的过氧化氢，使一种无色邻联甲苯胺形成一种有色化合物,最大吸收波长625 nm，可用比色分析葡萄糖的含量。 此法检出量0.01ug。详见书P125127酶-比色法、酶-电极法。,第四节多糖测定,聚合度由10到几千，常见有淀粉，纤维素，果胶等。 一、淀粉测定 （一）概述 1.淀粉粒的特性 淀粉是一种多糖。它广泛存在于植物的根、茎、叶、种子等组织中，是人类食物的重要组成部分，也是供给人体热能的主要来源。淀粉在植物细胞内以颗粒状态存在，故称淀粉粒。 形状：圆形、椭圆形、多角形等。 大小：0.0010.15毫米之间，马铃薯淀粉粒最大，谷物淀粉粒最小。 2. 淀粉的结构： 淀粉是由葡萄糖单位构成的聚合体，按聚合形式不同，可形成两种不同的淀粉分子，直链淀粉和支链淀粉。直链淀粉是由葡萄糖残基以。一1，4苷键结合构成的，分子呈直链状。 支链淀粉是由葡萄糖残基以。 1，4苷键结合构成直链主干，而支链通过第六碳原子以1，6苷链与主链相连，形成“树枝”状支叉结构。,淀粉粒的形状 1-小麦淀粉 2-大麦淀粉 3-玉米淀粉 4-大米淀粉 5-马铃薯淀粉,2、淀粉性质,（1）水溶性：直链淀粉不溶于冷水，可溶于热水；浓溶液易形成凝胶。 支链淀粉常压下不溶于水，只有在加热、加压时才能溶解于水，。 （2）醇溶性：不溶于浓度在30以上的乙醇溶液。 （3）水解性：在酸或酶的作用下可以水解，最终产物是葡萄糖。 （4）旋光性： 淀粉水溶液具有右旋性，20D为（+）201.5205。 （5）与碘作用： 淀粉遇碘呈蓝色， 淀粉遇碘呈蓝色。,（二）淀粉的测定方法,1、酶水解法 （1）原理：样品经除去脂肪和可溶性糖类后，在淀粉酶的作用下，使淀粉水解为麦芽糖和低分子糊精，再用盐酸进一步水解为葡萄糖，然后按还原糖测定法测定其还原糖含量，并折算成淀粉含量。 （2）适用范围及特点：因为淀粉酶有严格的选择性，它只水解淀粉而不会水解其他多糖，水解后通过过滤可除去其他多糖。所以该法不受半纤维素、 多缩戊糖、果胶质等多糖的干扰，适合于这类多糖含量高的样品，分析结果准确可靠，但操作复杂费时。 3、操作要点,4、结果计算:根据淀粉的水解反应： (C6HloO5)n+nH2O=n(C6Hl 2()6) 162 180 把葡萄糖含量折算为淀粉含量的换算系数为 162/1800.9。,推算淀 粉含量,作业五,1、简述你所知的铜测定糖的原理及特点？ 2、简述除铜法以外，其它还原糖的测定方法？ 3、简述除还原法以外，其它糖的测定方法？ 4、简述常见多糖测定方法,2、酸水解法,（1）原理：样品经乙醚除去脂肪，乙醇除去可溶性糖类后，用酸水解淀粉为葡萄糖，按还原糖测定方法测定还原糖含量，再折算为淀粉含量。 （ 2）适用范围及特点：此法适用于淀粉含量较高，而半纤维素和多缩戊糖等其他多糖含量较少的样品。对富含半纤维素、多缩戊糖及果胶质的样品，因水解时它们也被水解为木糖、阿拉伯糖等还原糖，使测定结果偏高。该法操作简单、应用广泛，但选择性和准确性不及酶法。 （3）操作要点,推算淀 粉含量,3、肉类制品中淀粉含量的测定（醇、碱法）,把样品与氢氧化钾酒精溶液共热，使蛋白质(AA)、脂肪溶解，而淀粉和粗纤维不溶解。过滤后，沉淀用氢氧化钾水溶液溶解淀粉，使之与粗纤维分离，然后用醋酸酸化的乙醇使淀粉重新沉淀，过滤后把沉淀于100烘干至恒重，再于550灼烧至恒重，灼烧前后重量之差即为淀粉的含量 。 此法适用于对于富含脂肪和蛋白质的样品，不适用于其他多糖含量较多的植物试样。方法测定的结果准确，但操作时间长。是北欧食品分析委员会对午餐肉，香肠、干酩中淀粉分析的标准方法。 （午餐肉淀粉含量，GB6%，加拿大4% ） 操作要点，,灼 烧 恒 重,4、高氯酸法,（1）原理：高氯酸、氯化钙等试剂，是种氢键断开剂。它们可以溶解淀粉分子，以萃取法达到分离淀粉与非淀粉物质的目的。这种方法，叫作选择性提取。 以含水乙醇除去可溶性糖分，再用高氯酸从其残留物中提取淀粉，用蒽酮法定量，最大吸收波长607nm。 （2）特点：此法适用于对于富含脂肪和蛋白质，含糖量低的样品，简单、快速，但干扰因素较多。 （3）操作要点,蒽酮比色剂 607nm比色分析,5、旋光法,（1）原理：淀粉具有旋光性，在一定条件下旋光度的大小与淀粉的浓度成正比。用氯化钙溶液提取淀粉，使之与其他成分分离 用氯化锡沉淀提取掖中的蛋白质后 测定旋光度 即可计算出淀粉含量。 （2）适用范围及特点：本法适用于淀粉含量较高，而可溶性糖类含量很少的谷类样品如面粉、米粉等。操作简便、快速。糊精干扰测定，对于一些来源不明、混合的、受热或变性淀粉，分析结果的误差较大。 操作要点,测滤液 旋光度,6、高压酸水解法,原理：在高压下用硫酸水解样品，使淀粉水解为葡萄糖，测定水解液中还原糖总量，同时测定样品总糖量，两者之差即为淀粉水解产生的还原糖量，再乘以换算系数即得淀粉含量。 适用范围及特点：适用于蔬莱、水果等淀粉含量较少的样品。淀粉及脂肪含量少，省了乙醚除脂肪和乙醇除可溶性糖的操作，避免处理过程中淀粉流失(当淀粉含量少时这种损失不可忽略)，简化了样品处理过程，改变了水解条件，从而大大缩短了测定时间。 7、酶比色法 原理：淀粉在淀粉葡萄糖苷酶(AGS)催化下，最终水解为葡萄糖。葡萄糖氧化酶(GOD)在有氧条件下，催化D-葡萄糖(葡萄糖水溶液)氧化，生成 -葡萄糖酸内酯和过氧化氢。受过氧化物酶(POD)催化，过氧化氢与4氨基安替比林和苯酚生成红色醒亚胺。在505nm波长处有最大吸收峰，可测定吸光度值，计算食品中淀粉的含量。 2适用范围及特点 本法选自GB/T 162871996，简单快速，选择性好，不受其他糖类物质的干扰，适用于各类样品中淀粉的测定，最低检出限量为0.09g/mL。但需专用试剂，价格昂贵，不易保存，应用受到限制。,8、蒽酮比色法,淀粉用稀酸水解为葡萄糖，然后在较高温度下用浓硫酸使葡萄糖脱水生成羟甲基糠醛，再使之与蒽酮缩合成蓝绿色的化合物。其呈色强度与溶液中葡萄糖的含量成正比，在630nm波长下测定吸光度，根据预先制得的标准曲线求得淀粉的浓度，再换算成样品中淀粉含量。 单糖、双糖、糊精和纤维素等都可与蒽酮试剂作用，故在淀粉水解前要除去这些干扰物质。 该法是微量法，适合于含微量淀粉的样品，具