食品生物化学第4章核酸.ppt

第四章 核酸,主要内容,核苷酸 脱氧核糖核酸和核糖核酸 核酸的理化性质及分离纯化,一、核酸的分类与组成,核酸分为两大类: 脱氧核糖核酸（DNA） 主要存在于细胞核内。 核糖核酸（RNA） 主要存在于细胞质中。,（一）核酸的分类,（二）核酸的组成,核酸（DNA和RNA）是一种线性多聚核苷酸，它的基本结构单元是核苷酸。 核苷酸本身由核苷和磷酸组成, 核苷则由戊糖和碱基形成 DNA与RNA结构相似，但在组成成份上略有不同。,核苷酸,磷酸,核苷,戊糖,碱基,核酸,1核苷酸,基本组成单位,嘌呤,嘧啶,（1）组成核苷酸的碱基,1核苷酸,腺嘌呤 A,鸟嘌呤 G,尿嘧啶 U,胞嘧啶 C,胸腺嘧啶 T,（2）戊糖,组成核酸的戊糖有两种。 DNA所含的糖为-D-2-脱氧核糖。 RNA所含的糖则为-D-核糖。,（3）核苷 nucleoside,碱基+戊糖=核苷 糖与碱基之间的C-N键，称为C-N糖苷键。,（4）核苷酸nucleotide,核苷酸是核苷的磷酸酯。 5-磷酸-脱氧核糖核苷-DNA 5-磷酸-核糖核苷-RNA,核苷+磷酸=核苷酸 核苷酸 脱氧核苷酸 腺嘌呤核苷酸 脱氧腺嘌呤核苷酸 AMP dAMP 鸟嘌呤核苷酸 脱氧鸟嘌呤核苷酸 GMP dGMP 胞嘧啶核苷酸 脱氧胞嘧啶核苷酸 CMP dCMP 尿嘧啶核苷酸 脱氧胸腺嘧啶核苷酸 UMP dTMP,(5)修饰成分,核酸中也存在一些不常见的稀有碱基。稀有碱基的种类很多，大部分是上述碱基的甲基化产物。,核苷酸的理化性质P89,碱基与紫外吸收：260 nm 疏水堆积作用 碱基互补配对,ATP是生物体内分布最广和最重要的一种核苷酸衍生物。,ATP (腺嘌呤核糖核苷三磷酸),2核苷酸的衍生物,腺苷酸及其多磷酸化合物,AMP Adenosine monophosphate,ADP Adenosine diphosphate,ATP Adenosine triphosphate,ATP的性质,ATP 分子的最显著特点是含有两个高能磷酸键。 ATP水解时, 可以释放出大量自由能。 ATP 水解释放出来的能量用于推动生物体内各种需能的生化反应。 ATP 是生物体内最重要的能量转换中间体。,多聚核苷酸,多聚核苷酸是通过核苷酸的5-磷酸基与另一分子核苷酸的C3-OH形成磷酸二酯键相连而成的链状聚合物。 由脱氧核糖核苷酸聚合而成的称为DNA链； 由核糖核苷酸聚合而成的则称为RNA链。,脱氧核糖核酸(DNA)的结构 核酸 核糖核酸(RNA)的结构,第二节 核酸的结构,一级结构: 由4种脱氧核苷酸通过3-5磷酸二酯键连接起来的直线形或环形多聚体。 二级结构: 核苷酸链内或链之间通过氢键折叠卷曲而成的双螺旋结构。绝大多数为右旋。 三级结构: 是指DNA分子在二级结构的基础上通过进一步的扭曲和折叠所形成的特定构象。,一、脱氧核糖核酸(DNA)的结构,DNA的一级结构-碱基序列 由4种脱氧核苷酸通过3-5磷酸二酯键连接起来的直线形或环形多聚体。 一级结构的走向的一般为53。 不同的DNA分子具有不同的核苷酸排列顺序，因此携带有不同的遗传信息。,二、DNA的一级结构,5-磷酸端（常用5-P表示）；3-羟基端（常用3-OH表示） 多聚核苷酸链具有方向性，当表示一个多聚核苷酸链时，必须注明它的方向是53或是35。,多聚核苷酸的表示方式,5PdAPdCPdGPdTOH 3 或5ACGTGCGT 3 ACGTGCGT,线条式,字母式,DNA的一级结构,RNA的一级结构,DNA与RNA的一级结构对照,二、DNA的二级结构,1953年，J. Watson和F. Crick 在前人研究工作的基础上，根据DNA结晶的X-衍射图谱和分子模型，提出了著名的DNA双螺旋结构模型，并对模型的生物学意义作出了科学的解释和预测。,DNA分子由两条DNA单链组成。 双螺旋结构是DNA二级结构的最基本形式。 DNA的双螺旋结构是分子中两条DNA单链之间基团相互识别和作用的结果。,1DNA双螺旋结构的特点,DNA双螺旋模型,B型结构 两条链反向平行，右手螺旋， 有大沟和小沟。 Z型结构 磷酸基在多核苷酸骨架上的分布呈Z字形。 左手螺旋，只有小沟。,2.0 nm,小沟,大沟,三B-DNA的结构,左手螺旋Z-DNA(a)和右手螺旋B-DNA(b)的测试图,DNA双螺旋结构的要点,(1) DNA分子由两条多聚脱氧核糖核苷酸链(简称DNA单链)组成。两条链沿着同一根轴平行盘绕，形成右手双螺旋结构。螺旋中的两条链方向相反，即其中一条链的方向为53，而另一条链的方向为35。,（2）嘌呤碱和嘧啶碱基位于螺旋的内侧，糖基位于螺旋的外侧，碱基环平面与螺旋轴垂直。,DNA双螺旋结构的要点,（3）螺旋横截面的直径约为2 nm，每条链相邻两个碱基平面之间的距离为0.34 nm，每10个核苷酸形成一个螺旋，其螺矩（即螺旋旋转一圈）高度为3.4 nm。,（4）两条DNA链相互结合以及形成双螺旋的力是链间的碱基对所形成的氢键。 碱基的相互结合具有严格的配对规律，即腺嘌呤（A）与胸腺嘧啶（T）结合，鸟嘌呤（G）与胞嘧啶（C）结合，这种配对关系，称为碱基互补。 A和T之间形成两个氢键，G与C之间形成三个氢键。 在DNA分子中，嘌呤碱基的总数与嘧啶碱基的总数相等。,DNA二级结构的多样性,回文序列,发夹式结构,十字形结构,中心区域,DNA回文序列及几种结构形式,DNA的双螺旋结构的意义,该模型揭示了DNA作为遗传物质的稳定性特征，最有价值的是确认了碱基配对原则，这是DNA复制、转录和反转录的分子基础，亦是遗传信息传递和表达的分子基础。,三、DNA的三级结构,在细胞内，由于DNA分子与其它分子（主要是蛋白质）的相互作用，使DNA双螺旋进一步扭曲或再螺旋形成的高级结构. 实例：超螺旋 染色体（ chromosome） 病毒（virus）,超螺旋,一个环形双螺旋DNA分子，通过细胞内旋转酶的作用，或在体外EB染料的作用下，可在环形分子内部引进张力。这种新产生的张力在DNA分子内部促使原子的位置重排，造成双螺旋的再螺旋，形状似麻花，称为超螺旋。 如果引起的张力的方向与原先的右手螺旋方向相同，则超螺旋的方向是左手螺旋，称为正超螺旋。正超螺旋是旋紧双螺旋后形成的。正超螺旋为双螺旋旋转过度，通过分子整体的左旋来解去过度的螺旋。 反之，如果引起的张力的方向与原先的右手螺旋方向相反，则超螺旋的方向是右手螺旋，称为负超螺旋。负超螺旋是放松双螺旋后形成的。,DNA超螺旋结构的形成,核小体盘绕及染色质示意图,真核生物染色体DNA组装 不同层次的结构,DNA （2 nm）,核小体链（ 11 nm，每个核小体200 bp）,纤丝（ 30 nm，每圈6个核小体）,突环（ 150 nm，每个突环大约75000 bp）,玫瑰花结（ 300 nm ，6个突环）,螺旋圈（ 700 nm，每圈30个玫瑰花）,染色体（ 1400 nm， 每个染色体含10个玫瑰花200 bp）,动物病毒切面模式图,被膜（脂蛋白、碳水化合物）,衣壳（蛋白质）,核酸,突起（糖蛋白）,病毒粒,（DNA或RNA）,二、 RNA的分子结构,一、 RNA一级结构和类别 二、 tRNA 的分子结构 三、 rRNA的分子结构 四、 mRNA的分子结构,一、 RNA的一级结构和类别,RNA与DNA的差异 DNA RNA 糖 脱氧核糖 核糖 碱基 AGCT AGCU 不含稀有碱基 含稀有碱基,1、RNA的一级结构,1、分子较小，一级结构为直线型多核苷酸链，因此，在RNA分子中，并不遵守碱基种类的数量比例关系，即分子中的嘌呤碱基总数不一定等于嘧啶碱基的总数。 2、基本单位主要是CMP、GMP、AMP和UMP四种核苷酸 3、磷酸二酯键，5端向3端延伸,局部为双螺旋结构，是RNA分子通过自身回折使互补的碱基对相遇，形成氢键结合而成，同时形成双螺旋。这种结构可以形象地称为“发夹型”结构。 不能配对的区域形成突环（loop），被排斥在双螺旋之外。 RNA中的双螺旋结构为A-DNA类型的结构。 一般来说，双螺旋结构占RNA分子的50%。,发卡式结构 A-U, C-G配对,2、RNA的类别,信使RNA（messenger RNA，mRNA）：在蛋白质合成中起模板作用； 核糖体RNA（ribosoal RNA，rRNA）：与蛋白质结合构成核糖体（ribosome），核糖体是蛋白质合成的场所； 转移RNA（transfor RNA，tRNA）：在蛋白质合成时起着携带活化氨基酸的作用。 小RNA（small nuclear RNA, snRNA），存在真核细胞中,分子量25000左右，大约由7090个核苷酸组成，沉降系数为4S左右。 分子中含有较多的修饰成分，稀有碱基。 3-末端都具有CpCpAOH的结构，用于接受活化的氨基酸，也称接受末端。 tRNA占全部RNA的16%，tRNA的生物功能是在蛋白质生物合成过程中转运氨基酸和识别密码子。 细胞内tRNA的种类很多，估计有50多种。每一种氨基酸都有与其相对应的一种或几种tRNA。,二、tRNA 的结构,生物大分子在单位离心力场作用下的沉降速度称为沉降系数。量纲为秒。一个svedberg单位，简写为S， 是110-13秒，8S即为810-13秒。相对分子量越大，S越大。 当一种新发现的大分子的结构、性质和功能等都处在研究阶段中时，其名称未定，为了描述方便，常用其沉降系数S来表示。 蛋白质的沉降系数在1200 S之间。,沉降系数,二级结构特征： 三叶草形 四臂四环,三级结构 特征： 在二级结构基础上 进一步折叠扭曲形成倒 L型,tRNA的二级结构,tRNA的二级结构都呈” 三叶草” 形状。 一般可将其分为五部分：包括氨基酸臂、反密码环、二氢尿嘧啶环、TC环和可变环（额外环）。,携带氨基酸,辨认并结合氨基酰tRNA合成酶,识别mRNA上的密码,识别并结合核蛋白体,氨基酸臂,二氢尿嘧啶环,反密码环,可变环,TC环,(1) 氨基酸臂 包含有tRNA的3-末端和5-末端， 3 -末端的最后3个核苷酸残基都是CCA。氨基酸可与其成酯，该区在蛋白质合成中起携带氨基酸的作用。 (2)反密码环 与氨基酸接受区相对的一般含有7个核苷酸残基的区域，其中正中的3个核苷酸残基称为反密码。 反密码子与结合在核糖体上的mRNA中的核苷酸（密码子）根据碱基配对原则互补成对，因此在蛋白质合成过程中，携带特定氨基酸的tRNA凭借自身的反密码子识别mRNA上的密码子，把所携带的氨基酸掺入到多肽链的一定位置上。 I次黄嘌呤核苷酸，也称肌苷酸，常出现在反密码子中。,（3）二氢尿嘧啶环 由812个核苷酸组成，因为含有两个而氢尿嘧啶而得名。通过由34对碱基组成的双螺旋区（也称二氢尿嘧啶臂）与tRNA分子的其它部分相连。 (4)可变环（额外环） 位于反密码区与TC区之间，不同的tRNA具有大小不同的额外环，所以是tRNA分类的重要指标。,（5）TC环 该区与二氢尿嘧啶区相对， 假尿嘧啶核苷胸腺嘧啶核糖核苷环(TC)由7个核苷酸组成，通过由5对碱基组成的双螺旋区(TC臂)与tRNA的其余部分相连。除个别例外，几乎所有tBNA在此环中都含有TC 。 T-胸腺嘧啶核糖核苷酸 -假尿嘧啶核苷酸,tRNA的三级结构,在三叶草型二级结构的基础上，突环上未配对的碱基由于整个分子的扭曲而配成对，目前已知的tRNA的三级结构均为倒L型。,tRNA的三级结构,倒 L 型,三、rRNA的分子结构,特征： 单链，螺旋化程度较tRNA低 与蛋白质组成核糖体后方能发挥其功能,5sRNA的二级结构,rRNA,动物细胞核糖体rRNA有四类：5S rRNA，5.8S rRNA，18S rRNA，28S rRNA。 大肠杆菌核糖体中的rRNA有三类：5S rRNA，16S rRNA，23S rRNA。这些不同的rRNA的核苷酸排列顺序是不同的，它们能与细菌染色体DNA的不同部位杂交。 rRNA约占全部RNA的80%左右。 rRNA的功能是构成核糖体的骨架。,四、mRNA的分子结构,原核生物mRNA特征： 先导区+翻译区（多顺反子）+末端序列 真核生物mRNA特征： “帽子”+单顺反子+“尾巴”,顺反子，是遗传学名词，指mRNA分子中对应于 DNA上一个完整基因的一段核苷酸序列。,多顺反子，即一条mRNA链含有指导合成几种蛋白质分子的信息，可作为模板翻译出几种蛋白质。,单顺反子，即一条mRNA链只能翻译产生一种蛋白质。,原核细胞mRNA的结构特点,真核细胞mRNA一级结构的特点,真核细胞mRNA的3-末端有一段长达200个核苷酸左右的聚腺苷酸(poly A)，称为 “尾结构” 。 真核细胞mRNA的5-末端有一个甲基化的鸟苷酸，称为 “帽结构 ” 。,3 -非编码区,5 -非编码区,编码区（单顺反子）,5 帽子,3 poly A尾,5帽子：m7G-5ppp-Nm-3p,G鸟苷 N任意核苷 m在字母左侧代表碱基被甲基化，右上角的数字代表甲基化的位置 m在字母右侧表示核糖被甲基化,原核生物的mRNA一般无poly A，但某些病毒mRNA也有3-poly A。 poly A可能有多方面功能： 与mRNA从细胞核到细胞质的转移有关； 与mRNA的寿命有关，新合成的mRNA的poly A链较长，而衰老的mRNA的poly A链缩短。,化学结构决定物理化学性质 水解核酸的糖苷键、磷酸二酯键 酸碱性质磷酸基、碱基 紫外吸收碱基 核酸的变性、复性双螺旋结构,第三节 核酸的性质,（一）一般性质： 分子大小：DNA Mr 1061012或更大，RNA Mr 104105或更大 性状： DNA为白色纤维状固体（絮状），而RNA为白色粉末。 溶解度：DNA和RNA均微溶于水，不溶于一般的有机溶剂，所以常用乙醇做沉淀剂，使其从溶液中析出。,与蛋白质相似，核酸分子中既含有酸性基团（磷酸基）也含有碱性基团（氨基），因而核酸也具有两性性质。 由于核酸分子中的磷酸是一个中等强度的酸，而碱性（氨基）是一个弱碱，所以核酸的等电点较低。如DNA的等电点为44.5，RNA的等电点为22.5。 RNA的等电点比DNA低的原因，是RNA分子中核糖基2-OH通过氢键促进了磷酸基上质子的解离，而DNA没有这种作用。,（二）核酸的两性性质及等电点,碱基与戊糖形成的糖苷键、以及磷酸酯键均能被酸、碱和酶水解。 酸水解 糖苷键比磷酸键更容易被水解; 嘌呤碱的糖苷键比嘧啶碱的糖苷键更容易被水解; 水解嘧啶碱需要较高的温度. 比如：DNA在pH1.6于37 对水透析，可完全除去嘌呤碱；在pH 2.8于100 加热1 h也可完全除去嘌呤。,（三）核酸的水解,碱水解,RNA的磷酸酯键易被碱水解成核苷酸，DNA的磷酸酯键则不易被碱水解。 这是因为RNA核糖上2-OH在碱的作用下形成的磷酸三酯极不稳定，容易水解。 DNA的脱氧核糖没有2-OH，不能形成碱水解的中间产物，因而对碱有一定的抗性。 用于水解RNA的碱有KOH，NaOH等。,碱水解RNA：碱浓度一般为0.31 mol/L，在室温至37 下水解1824 h，产物为2-和3-单核苷酸。 碱水解DNA：1 mol/L NaOH于100 加热4 h，可得到小分子的寡聚脱氧核苷酸。,酶水解,磷酸二酯酶：非特异性水解磷酸二酯键 核酸酶：专一水解核酸的磷酸二酯键 分类 1）按底物专一性：核糖核酸酶（RNase），脱氧核糖核酸酶（DNase） 2）按作用方式：内切酶，外切酶 核酸外切酶的作用方式是从多聚核苷酸链的一端（3-端或5-端）开始，逐个水解切除核苷酸。 核酸内切酶的作用方式刚好和外切酶相反，它从多聚核苷酸链中间开始，在某个位点切断磷酸二酯键。 3）其它：限制性核酸内切酶，双链酶，单链酶 在分子生物学研究中最有应用价值的是限制性核酸内切酶。这种酶可以特异性的水解核酸中某些特定碱基顺序部位。,(四)核酸的紫外吸收,在核酸分子中，由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系，因而具有独特的紫外线吸收光谱（240290 nm），一般在260 nm左右有最大吸收峰。 不同碱基的紫外吸收特性不同；同一种碱基在不同pH、不同波长下的紫外吸收也不同，据此，可以作为核酸及其组份定性和定量测定的依据。,紫外吸收是实验室最常用的定量测定DNA或RNA的方法。 鉴定DNA和RNA的纯度： 待测样品的纯度可用它们的A260/A280来判断。纯DNA的A260/A280为 1.8，而纯RNA的A260/A280为 2.0。 样品中若含有蛋白质-? 则：A260/A280值要下降，因为蛋白质的最大吸收在A280。,核酸溶液的紫外吸收还可以摩尔磷的吸光度来表示，摩尔磷相当于摩尔核苷酸。 单链核酸的摩尔磷吸收值高于双链核酸的摩尔磷吸收值，这是因为双螺旋结构使碱基对的电子云发生重叠，因而减少了对紫外光的吸收。 所以，核酸发生变性时，核酸的摩尔磷吸收值升高约25%，这种现象成为增色效应；复性后，摩尔磷值又降低，这种现象叫做减色效应。,（五）核酸的变性、复性与杂交,(1) 核酸的变性 核酸的变性是指核酸双螺旋区的多聚核苷酸链间的氢键断裂，变成单链结构的过程。 变性核酸将失去其部分或全部的生物活性。核酸的变性并不涉及磷酸二酯键的断裂，所以它的一级结构(碱基顺序)保持不变。 能够引起核酸变性的因素很多。温度升高、酸碱度改变pH（11.3或5.0）；甲醛和尿素等的存在均可引起核酸的变性。,DNA变性的特征,DNA的变性过程是突变性的，它在很窄的温度区间内完成。因此，通常把加热变性使DNA的双螺旋结构失去一半时的温度称为融点，用Tm表示。 一般DNA的Tm值在70-85 C之间。DNA的Tm值与分子中的G和C的含量有关。 G和C的含量高，Tm值高。因而测定Tm值，可反映DNA分子中G, C含量，可通过经验公式计算： （G + C)%=(Tm - 69.3) 2.44,淬火：如当温度高于Tm约5 时，DNA的两条链由于布朗运动而完全分开。如果此热溶液迅速冷却，则两条链继续保持分开，称为淬火。 退火：若将此溶液缓慢冷却，到适当的低温，则两条链可发生特异性的重新组合而恢复到原来的双螺旋结构，称退火。 变性的因素：加热、酸碱、乙醇、丙酮等有机溶剂、尿素、酰胺等试剂。,当DNA的稀盐溶液加热到80-100 时，双螺旋结构即发生解体，两条链彼此分开，形成无规线团。 DNA变性后，它的一系列性质也随之发生变化，如紫外吸收(260 nm)值升高, 粘度降低等。,粘度 天然DNA分子的长度可达到几个厘米，而分子的直径只有2 nm，所以即使是极稀的DNA溶液，也有极大的粘度。RNA的粘度要小得多，当核酸溶液因受热或在其他因素作用下发生螺旋线团转变时，则粘度降低。,(2) 核酸的复性,变性DNA在适当的条件下，两条彼此分开的单链可以重新缔合成为双螺旋结构，这一过程称为复性。DNA复性后，一系列性质将得到恢复，但是生物活性一般只能得到部分的恢复。 DNA复性的程度、速率与复性过程的条件有关。 将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。但是将变性的DNA缓慢冷却时，可以复性。分子量越大复性越难。浓度越大，复性越容易。此外，DNA的复性也与它本身的组成和结构有关。,(3) 核酸的杂交,热变性的DNA单链，在复性时并不一定与同源DNA互补链形成双螺旋结构，它也可以与在某些区域有互补序列的异源DNA单链形成双螺旋结构。这样形成的新分子称为杂交DNA分子。 DNA单链与互补的RNA链之间也可以发生杂交。 核酸的杂交在分子生物学和遗传学的研究中具有重要意义。,核酸的杂交,一、DNA的复制与生物遗传信息的保持 DNA复制的要点是： 1）在复制开始阶段，DNA的双螺旋拆分成两条单链。,2）以DNA单链为模板，按照碱基互补配对的原则, 在DNA聚合酶催化下，合成与模板DNA完全互补的新链，并形成一个新的DNA分子。,3) 通过DNA复制形成的新DNA分子, 与原来的DNA分子完全相同。 经过一个 复制周期后，子代DNA分子的两条链中，一条来自亲代DNA分子，另一条是新合成的，所以又称为半保留复制。,核酸的研究方法,核酸的分离和提纯 超速离心 琼脂糖凝胶电泳,核酸的分离、提纯,DNA的分离 RNA的分离 制备DNA需要注意的问题：防止核酸的降解和变性。 制备条件：温和，低温（04 ），防止过酸、过碱、避免剧烈搅拌；防止核酸酶的作用（加入十二烷基硫酸钠SDS、乙二胺四乙酸EDTA、柠檬酸钠等抑制核酸酶活性）,DNA的分离,原理：真核生物中的染色体DNA与碱性蛋白（组蛋白）结合成核蛋白（DNP）存在细胞核中。DNP溶于水和浓盐溶液（如1 mol/L NaCl），但是不溶于生理盐水(0.14 mol/L NaCl)。 DNA分离方法： 1.破碎细胞后，用浓盐溶液提取。 2.用水稀释至0.14 mol/L 盐溶液，使DNP沉淀出来。 3. 除去蛋白质 用氯仿-戊醇溶液抽提：将DNP溶于高氯酸钠溶液，再与等体积的氯仿-戊醇溶液混合，振荡，离心，溶液分为三层，上层为核酸，中层为类脂，下层为蛋白质。 如此反复操作多次除净蛋白。 4. 除去少量RNA：用核糖核酸酶溶液50 g/ml于37 保温30 min。 5. 将含DNA的水相合并，用7090%的乙醇洗去盐分。 保存：将提纯的DNA溶于缓冲液，于4 保存。,RNA的分离,RNA比DNA更不稳定，而且RNase又无处不在。 注意： 1）所有用于制备RNA的玻璃器皿都要经过高温焙烤，塑料用具经过高压灭菌，不能灭菌的用具要用0.1%焦炭酸二乙酯（DEPC）处理，再煮沸以除净DEPC。DEPC能破坏 RNase。 2）在破碎细胞同时加入