细菌的凝集试验原理.ppt

抗原抗体反应及免疫学标记技术 生物病原与免疫学系,医学免疫学 实验二,主要内容,讨论： 第一节 抗原抗体反应概述 概念、原理、特点及影响因素 第二节 抗原抗体反应类型 示教： 单向琼脂扩散干板、双向琼脂扩散干板、 火箭电泳干板、对流免疫电泳干板 细菌的凝集实验 操作： 夹心ELISA检测特定抗原HBsAg 胶体金试纸检测HCG,抗原抗体反应原理,抗原与相应抗体的特异性结合反应称为抗原抗体反应(antigen-antibody reaction)。,抗原抗体反应概念,抗原抗体结合反应是抗原决定簇和抗体分子超变区之间的相互作用，是一种分子表面的特异的可逆的弱结合力。这些弱结合力只能在极短距离内才能发生效应。,第一节 抗原抗体反应概述,抗原抗体结合力,抗原和抗体的结合具有互补性，是通过非共价键进行特异性结合，抗原与抗体这种弱的结合力涉及下列几种分子间的作用力：,l.静电引力,2.范德华引力,3.氢键结合力,4.疏水作用力,抗原抗体反应的特点,一.特异性 二.比例性 三.可逆性 四.阶段性,影响抗原抗体反应的因素,抗原抗体结合过程可分为两个阶段：一是特异性结合阶段，二是可见反应阶段。,1、抗原、抗体的浓度、比例,4、温度,5、酸碱度,37,pH 6-8,正常人体内环境,3、电解质离子浓度,2、反应时间,第二节 抗原抗体反应类型,* 抗原抗体的检测,（一）检测原理,抗原与相应抗体可发生特异性结合，并在外界条件影响下出现肉眼可见或借助仪器可检测的各种现象，如凝集或沉淀。借此可用已知抗体（或抗原）检测未知抗原（或抗体），因所采用的抗体常存在于血清中，故称为血清学反应。,Ag,Ag,Ag,Ag,Ag,Ag,Ag,Ag,（二）抗原或抗体的检测实际意义,评价机体免疫功能状况 相关疾病诊断 了解相关疾病发病机制 相关药物及激素浓度监测,（三）抗原抗体反应的基本检测方法,1、凝集反应,细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后形成凝集团块，此类反应称为凝集反应。,根据抗原的性质、出现结果的现象、参与反应的成分的不同，抗原抗体反应可分为凝集反应、沉淀反应、免疫标记技术等。,（1）直接凝集,红细胞,抗红细胞抗体（IgM）,+,凝集,用于：ABO血型测定 细菌鉴定,（2）间接凝集,激素抗体,激素分子,不凝集,+,激素抗体,激素包被的乳胶颗粒,+,凝集,常用载体：绵羊红细胞、聚苯乙烯乳胶等。 用于：钩端螺旋体病、血吸虫病、类风湿关节 炎的辅助诊断。,（3）间接凝集抑制试验,用于：早孕的检测,+,+,激素分子,不凝集,2、沉淀反应,可溶性抗原与相应抗体在有适量电解质存在下，出现肉眼可见的沉淀现象，称为沉淀反应。,该反应多用半固体琼脂凝胶作为介质进行琼脂扩散或免疫扩散，即可溶性抗原 与抗体在凝胶中扩散，在比 例合适处相遇形成可见的白 色沉淀现象。,（1）单向免疫扩散,Ab,待测血清（Ag）,不同浓度的标准血清,d,c,d,火箭电泳,（2）双向免疫扩散,Ag,Ab,将抗原与抗体分别加入琼脂凝胶的小孔中，抗原抗体会自由地向四周扩散，在它们相遇的位置形成一条沉淀线。是一种定性检测法。,Ag1,Ag1,Ab1,Ag1,Ag2,Ab1、2,Ag1,Ab1、2,对流免疫电泳？,（3）免疫电泳,（4）免疫比浊,待测Ag,Ab槽,已知Ag,+,-,Ag2,Ag3,Ag1,Ag,根据不同量抗原抗体反应所形成的浊度不同判断样品中未知抗原的含量。,3 、免疫标记技术,免疫标记技术是用荧光素、酶、放射性核素、胶体金或化学发光物质等标记抗体或抗原，利用标记技术的高度敏感性进行抗原抗体检测。,可见,优点:灵敏度高、快速、可定性、定量、定位。,分类：根据标记物的不同，免疫标记技术可分为免疫荧光技术、免疫酶技术、放射免疫技术、胶体金和化学发光技术。,胶体金,（1）免疫荧光技术,常用荧光素：异硫氰酸荧光素（FITC）和藻红蛋白（PE）。,直接法,间接法,冲洗,冲洗1,冲洗2,可通过荧光显微镜或流式细胞仪观察荧光。,（2）免疫酶技术,将抗原抗体反应的特异性与酶催化底物的高效性相结合,通过酶作用于底物后的显色反应判定结果。常用方法:酶标免疫组化法及酶联免疫吸附法等,常用标记酶:辣根过氧化物酶(HRP),邻苯二胺,HRP,催化,显黄色,E,Ag,OPD,Ab,HRP,酶联免疫吸附试验(ELISA),双抗体夹心法,间接法,将抗原抗体反应在固相上进行,通过洗涤除去游离成分.目前是应用最广的免疫酶技术。,待测为抗原,待测为抗体,冲洗,（3）放射免疫技术(RIA),定义：用放射性核素标记抗原或抗体进行免疫检测的方法。,常用标记物：125I和131I,特点：灵敏度高（pg），故用于测量微量物质，如胰岛素、生长激素、甲状腺素、孕酮等激素、吗啡、地高辛、IgE等。,但放射性核素有一定危害性，使得放射性免疫激素的应用受到一定限制。,免疫学测定方法敏感性比较,示教1：免疫沉淀反应,1.单向琼脂扩散干板 2. 双向琼脂扩散干板 3.火箭电泳干板 4.对流免疫电泳干板,25,示教2：细菌的凝集试验,原理：细菌是颗粒性抗原，与相应抗体结合后形成凝集团块，此类反应称为直接凝集反应。 操作：,生理盐水,生理盐水,可疑病原菌,可疑病原菌,沙门氏菌属多价O血清,志贺氏菌属多价血清,实验操作1：双抗夹心法检测特定抗原,检测抗原最常用ELISA， 适用于检测具有至少两个抗原决定簇的多价抗原。 原理： 1、利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合，形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物。 2、复合物的形成量与待测抗原的含量成正比。 3、测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物的量(OD值)，即可确定待测抗原含量。,双抗夹心法 （sandwich ELISA）,实验材料：,1、固相载体： 作为吸附剂和容器 ELISA板的特点是可以同时进行大量标本的检测，并可在酶标仪上迅速读出结果。,29,2、酶结合物：酶与抗体或抗原联结的产物 具有酶促反应，显示出生物放大作用。 常用的酶为辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)和碱性磷酸 酶(alkaline phosohatase, AP)。 3、酶的底物 （1）HRP催化过氧化物的氧化反应。 底物：邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB) ，用酸中止反应 （2）AP为磷酸酯酶 底物：硝基苯磷酸酯(p-NPP)，用碱中止反应 4、样本 5、稀释液、洗涤液及终止液,30,实验方法:,1. 编号：每组一个酶标条，第一小组6个孔（多一孔为阳性对照），其余小组5孔，分别编为1、2、3、4、5、（6）； 2. 稀释：每孔加入20L样品稀释液（内含BSA，可以起封闭作用，此步骤已由实验教师提前完成） 3. 加样：按以下顺序每孔用加样枪加入100L：1-1号病人血清、2-2号病人血清、3-3号病人血清、4-空白对照（PBS）、5-阴性对照、6-阳性对照；（5分钟内完成） 4. 温育：置37温育40分钟； 5. 加酶：分别在每孔中加入酶标记抗体1滴（50L）；（3分钟内完成） 6. 温育：置37温育30分钟； 7. 洗涤：用洗涤液充分洗涤5次，洗涤后扣干（每次静置30秒） 8. 显色：每孔加底物A、B各1滴（50L），置37温育5分钟； 9. 终止：每孔加入终止液1滴（50L）；（2分钟内完成） 10. 测定：用酶标仪于450nm测定各孔OD值，并记录结果。,样本加样方法：,*每孔用加样枪分别加入相应样本100L,DNM-9602G酶标分析仪,DNM-9602 标配酶标分析仪,DNM-9602A酶标分析仪,几种酶标分析仪,实验结果判断：,实验操作2：胶体金试纸检测HCG,此法是基于胶体金/抗体复合物快速色谱法来检测尿液中HCG (人体绒膜促性腺激素)的含量 在受孕后7天即可以检测到尿液中的hCG HCG浓度峰值在怀孕约9 - 12周 HCG的量与妊娠年龄及个体差异有关，胶体金试纸可以检测到尿液中极低含量的HCG，敏感性强,35,早孕试纸检测原理,C Line is coated with goat anti-mouse Ab,T Line is coated with an anti-hCG capture Ab,The test strip consists of a conjugate pad containing mouse anti-hCG Ab conjugated to colloidal gold, and a nitrocellulose membrane strip containing T line and C line,36,36,早孕试纸检测原理,C: Control zone containing anti-hCG antibody to give pink-rose band T: Test zone containing antibody-gold conjugate forming an antibody-antigen complex with urine hCG to form pink-rose band Negative Result: only one pink-rose band in C zone will appear Positive result: two pink-rose bands will form, one on C and other is on T zo