《CR技术及PCR仪》PPT课件.ppt

PCR技术及PCR仪,目 录,PCR技术简史 PCR的原理 PCR的反应体系和方法 PCR的类型和应用,PCR技术简史,DNA的复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明,PCR技术简史,DNA的复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明,引物酶,引物酶,PCR技术简史,DNA的复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明,DNA 聚合酶,DNA 聚合酶,PCR技术简史,DNA的复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明,PCR技术简史,DNA的复制 核酸体外扩增的设想 聚合酶链反应的发明,Kary B. Mullis,1989年美国Science杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。,故事发生在1983年 的春夏之交,Kary B. Mullis (1944 -)，在Cetus公司工作期间，发明了PCR。 他原本是要合成DNA引物来进行测序工作， 却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。1983年春夏之交的一个晚上，他开车去乡下别墅的路上萌发了用两个引物（而不是一个引物）去扩增模板DNA 的想法.,很少有在公司工作的科研人员得 诺贝尔奖， Mullis是其中之一,Mullis开车的时候, 瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成着DNA， ,Mullis的第一个PCR实验,1983年9月中旬。 Mullis在反应体系中加 入DNA聚合酶后在37 一直保温。结果第二 天在琼脂糖电泳上没有 看到任何条带。于是他认识到有必要用加热来解链，每次解链后再加入DNA聚合酶进行反应，依次循环。1983年12月，他终于看到了被同位素标记的PCR条带。,PCR的发展史,1983年春，Mullis发展出PCR的概念； 1983年9月，Mullis用大肠杆菌DNA聚合酶做了第一个PCR实验，只用一个循环； 1983年12月，用同位素标记法看到了10个循环后的49 bp长度的第一个PCR片断； 1985年12月20日，Mullis的同事Saiki在Science上发了一篇论文，方法中用了PCR技术，导致Mullis的文章到处被拒； 1985年10月25日申请了PCR的专利，1987年7月28日批准（专利号4,683,202 ），这回Mullis是第一发明人。 1986年5月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习PCR的方法； 1986年6月，Cetus公司纯化了第一种高温菌DNA聚合酶，Taq DNA polymerase，这是85年春天Mullis建议做的； 1988年，第一台PCR仪问世； 1991年，Hoffman LaRoche以3亿美元的代价从Cetus公司获得全权开发权。,PCR不只是一个方法改进,Mullis的上司有句“名言”，“我们要扩增这么多DNA样品有什么用”； 到了1991，Cetus公司以3亿美元的转让费将PCR相关专利转让给瑞士Hoffman LaRoche公司，并在此后的经营中又获得了数亿美元的分红； Mullis于1993年获得诺贝尔化学奖，PCR和DNA重组技术一样意义深远。,生物样品,DNA片段,基因诊断,基因治疗,基因工程产品,法医学检测,人类学研究,基因组DNA,获取特定DNA片段,扩增特定DNA片段,DNA聚合酶,引物,引物,引物,引物,Mullis的构思,DNA聚合酶,DNA聚合酶,94变性,50-65退火,XX延伸,94,55,37,Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus),酶活性(%),温度(),40 50 60 70 80 90 100,100 80 60 40 20,72,94,55,PCR循环,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,重复13步 2530轮,目的DNA片段 扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链 与引物复性,DNA变性 形成2条单链,子链延伸 DNA加倍,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,模板DNA,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,引物1,引物2,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,引物1,引物2,Taq酶,Taq酶,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,第1轮结束,第2轮开始,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,第2轮结束,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,模板DNA,第1轮扩增,第2轮扩增,第3轮扩增,第4轮扩增,第5轮扩增,第6轮扩增,PCR 动画,1st cycle,2nd cycle,3rd cycle,过 程,变 性,引 物 退 火,DNA 复制,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,PCR具有极高的灵敏度,样品,正对照,负对照,标准分子量,污染是PCR实验的常见问题。只要实验室里曾经扩增过某个片段，就有可能以后的实验中发生污染。,因此，做实验的时候绝对不要忘了负对照。 用紫外灯破坏污染物也是一个办法,PCR,琼脂糖凝胶电泳,最终产物,紫外光观察,3-4 小时,引物设计： （1)序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。 （2）引物长度以15-40 bp为宜。 （3）碱基尽可能随机分布，G+C占50-60%。 （4）引物内部避免形成二级结构。 （5）两引物间避免有互补序列。 （6）引物3端为关键碱基；5端无严格限制。,3,5,3,5,限制性内切酶的识别序列 启动子序列 定点突变 探针标记,1）PCR反应成分,（1）模板 单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 一般100ng DNA模板/100L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。,PCR反应条件,（2）引物浓度 0.1-0.5 mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。 （3）Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 0.5-2.5 U/50 l 酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。,耐高温DNA聚合酶的种类,Taq DNA聚合酶 (Thermus aquaticus，Cetus/Roche) Tth DNA聚合酶 (Thermus thermophilus，Toyobo) Pfu DNA聚合酶 （Pyrococcus furiosus，Stratagene） Deep Vent DNA聚合酶 (Bio-labs） Tfl DNA聚合酶 （Thermus flavus，Promega) Tli DNA聚合酶 (Thermococcus litoralis，Promega) Vent DNA聚合酶 (Bio-labs） Pwo DNA聚合酶 ( Pyrococcus woesei，Roche) Pfx DNA聚合酶 (Thermococcus kodakaraensis, Invitrogen) Dynazyme DNA聚合酶（Thermus brockianus，Finnazyme） FD DNA聚合酶 (Thermus sterophilus？，复旦大学) Tma, Tne, KOD, ,PCR反应中Taq酶的选择,高特异性：热启动Taq酶-高温激活 修饰（抗体抑制剂、蜡封等）如Clongtechstratagen等公司或重组酶，如QIAGEN公司的HotStar系列 高保真Taq酶（因其具有3”到5“核酸外切酶活性，错配率10-6，）普通Taq酶2510-5碱基/循环，如Stratagene的Pfu，NEB公司的Vent DNA聚合酶， QIAGEN公司的ProofStar DNA聚合酶，兼特异性与保真性于一体 高耐热性Taq酶 NEB公司的Vent 和Deep Vent DNA聚合酶系列，从海底火山口分离后克隆的，是普通Taq酶耐热性的三倍以上，前者在95 半衰期近7h，100 近2h；后者更甚分别为23h和8h,超长片段扩增Taq酶；基因组图谱、测序及分子遗传学研究。Clontech公司的Advantage Genomic系列混有TthDNA聚合酶，Proofreading酶和热启动抗体，对复杂模板可扩增10kb片段，简单模板可达40kb。 关于复杂模板的扩增 对于模板结构复杂，如GC含量高（60%），有二级结构等，普通的Taq酶可能难以延伸下去，加入DMSO等助溶剂可帮助扩增顺利进行，但DMSO有毒，而且用量需要优化。QIAGEN公司的任何一种Taq酶都附有特制的Q-溶液，操作方便、安全，对复杂模板的扩增特别有效。,（4）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。,（5） Mg2+,Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。 0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。 Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性。 Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。,2）循环参数,变性 使双链DNA解链为单链 95 20-30秒 变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，9394 1 min足以使模板DNA变性，若低于93则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。,(2)退火(复性)温度与时间： 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。 退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至4060，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度： Tm值(解链温度)=4(G+C)2(A+T) 复性温度=Tm值-(510) 在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合， 提高PCR反应的特异性。复性时间一般为3060sec，足以使引物与模板之间完全结合。,（3）延伸温度与时间： Taq DNA聚合酶的生物学活性： 7080 150核苷酸/S/酶分子 70 60核苷酸/S/酶分子 55 24核苷酸/S/酶分子 高于90时， DNA合成几乎不能进行。 PCR反应的延伸温度一般选择在7075之间，常用温度为72，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够 的。34kb的靶序列需34min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。,（4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加,PCR产物生成曲线,logDNA,Cycles,logDNA,Cycles,不同样品有不同的生成曲线,PCR的类型和应用,研究 基因克隆，DNA测序，分析突变 诊断 细菌、病毒、寄生虫检测，诊断 人类基因组工程 遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱 法医 犯罪现场标本分析 肿瘤 各种肿瘤检测 其他,PCR相关的术语和产品层出不穷,T-vector HotStart Taq RT-PCR RAPD-PCR DDRT-PCR LM-PCR Inverse PCR Nested PCR Real-time PCR RACE Flow chip PCR,TAS Multiplex PCR Immuno PCR Asymmetric PCR LP-PCR NASBA Recombinant PCR AFLP SSCP In situ PCR TaqMan/SYBR green,1）不对称PCR 目的：扩增产生特异长度的单链DNA。 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.010.5M,关键是限制性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针 基因组DNA结构功能的研究,高浓度引物,低浓度引物,2)反向PCR (reverse PCR),是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。 可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。,已知序列,未知序列,未知序列,已知序列,未知序列,未知序列,限制酶,限制酶,连接酶,3）多重PCR,用于检测特定基因序列的存在或缺失。,电泳,引物,4）LP-PCR（Labelled primers),利用同位素、荧光素等对引物进行标记，用以直观地检测目的基因。 特别适合大量临床标本的基因诊断 可同时检测多种基因成分,病毒1 病毒2 病毒 3 病毒4,标记引物,观察,PCR产物,5）锚式PCR,已知靶基因片段两测的序列,cDNA,末端核酸转移酶,3GGGG,5,CCCC 锚定引物,3GGGG,5,CCCC,3GGGG,CCCC,6）原位,原位聚合酶链式反应（In Still PCR，IsPCR）是由Haase等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段，在不破坏细胞的前提下，利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。 直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行扩增。可进行细胞内定位。 适用于检测病理切片中含量较少的靶序列,原位PCR的作用 既往鉴定细胞内特异序列一般采用原位杂交（ISH），但在每个细胞中目的片段的拷贝数少于10的情况下，该方法的敏感度就明显下降。而标准的PCR则可扩增出细胞内单拷贝的序列，敏感度很高，但却未能与细胞形态学研究相结合。 ISPCR则可把这两者结合起来，成为细胞学诊断中一种崭新的检测技术。利用该法可检测细胞内病毒感染、细胞内基因重排、以及分析细胞内RNA表达产物等方面发挥一定作用。在检测细胞的潜在感染方面也具有重要意义。,操作步骤 细胞或组织的固定 PCR扩增细胞内目的片段 原位杂交检测扩增产物,人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片,7）,逆转录酶,聚合酶,mRNA,cDNA,杂化双链,PCR扩增,基因,mRNA,蛋白质多肽链,8）实时定量PCR技术原理,普通PCR和定量PCR的区别,适用定性分析，不适合定量分析； PCR 产物的长度从100bp 数kb,实时检测:每个循环都产出荧光信号 绝对定量，灵敏度更高 PCR产物的长度一般在 60-150 bps,logDNA,Cycles,不同样品有不同的生成曲线,TaqMan系统的一个例子,10ng,0.001ng,Titrate a template; 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001 ng,PCR的应用领域,生物学领域几乎无处不用,基因、DNA片段的克隆 人工基因构建 DNA序列测定 基因定点突变 基因型（突变）检测， SNP分析，遗传背景分析 生物物种鉴定，系统进化研究 基因表达量研究（real-time PCR） / 基因表达谱研究（ DNA chip, SAGE）,医学领域,疾病基因检测 / 遗传病的产前诊断 致病病原体的检测 肿瘤治疗中癌基因的检测 会推广到大部分疾病治疗前的检测 DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别、法医物证 其他: 动、植物检疫（转基因动植物检测）,PCR技术的应用,1) 基因克隆,2)基因检测,A,内源性病变基因,正常人,A,病 人,病原微生物基因,正常人 (-),病 人 (+),遗传病的诊断,基因缺失、插入或置换等,地中海贫血,珠蛋白链合成不平衡,A,正常人,病 人,正常,病人,探针杂交,NC膜,探针,正常人,突变纯合子,突变杂合子,PCR-RFLP法：,限制性内切酶,恶性肿瘤（癌基因或抑癌基因）,Ras基因,突变,限制性内切酶,正常,突变,电泳,HLA系统基因分型,PCR-RFLP法,PCR-SSO法,PCR-SSCP,PCR-SSP,3)基因配型,4）基因鉴定,女性,男性,Y引物,PCR,男性 女性,法医学分析,个体识别、亲缘鉴定 方法：PCR-RFLP DNA遗传指纹 PCR-ASO PCR-VNTR多态性 PCR-SSCP 线粒体DNA测序,PCR-VNTR多态性检测,PCR；电泳检测,父 父 子 母,现 嫌1 嫌2 嫌3,PCR仪,(一) PCR基因扩增仪的类型,PCR仪，也称DNA热循环仪、基因扩增仪 PCR基因扩增仪的设计均按照DNA变性、复性和延伸三个环节以及温度均恒、传导快和升降温迅速等原则，结合传感技术、微电子技术和电子计算机等技术发展而成的自动化和智能化的仪器设备,1971年Kleppe等人在Journal of molecular biology上发表文章首次准确、精炼、客观的阐述了PCR方法， 1976年一种从嗜热水生菌(Thermus aquaticus)分离得到的热稳定的DNA依赖的DNA聚合酶的应用大大增加了PCR的效率。 而现今所发展出来的PCR则是源于由Saiki和Mullis等人于1988年发表在Science上的一篇论文，Mullis当时服务于Perkin Elmer（PE）公司，因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。 后来PE被Applied Biosystems Inc.（ABI）公司收购、分拆、再转卖，而PCR的专利和倍受信赖的PCR仪器生产和销售就留在ABI名下。 到如今，PCR方法愈发趋向自动化，并从中衍生出更多的新技术方法，可以说，PCR技术是支撑现代分子生物学发展的一块重要基石。这种技术的广泛应用催生了一个庞大的市场，多个公司均有各种类型的商品化PCR仪出售。 PCR的专利目前依然掌握在ABI和Roche（罗氏）两大公司手中，去年业界颇为引人瞩目ABI诉MJ公司侵犯侵犯PCR仪知识产权案最终以MJ败诉并宣布破产、最终被Bio-rad收购暂告一段落。其后还会不会有后继的故事还需拭目以待。,PCR仪器的变迁,三个水浴锅， 用手移动 （Mullis等人当时用的） 电加热块 自来水冷却 （PE，1988） 电加热块 内置循环液冷却 （PE，1989） 三个加热块 机械手 （Stratagene，1994） 半导体制冷和加热 （MJ, PE, BioMetra, Eppendrof） 温度梯度, 荧光检测 (如 Roche的Lightcycler) 风加热 Lab-on-chip式的PCR仪(所谓的芯片PCR) 中国的状况 1991年出现三个水浴锅+机械手的原始PCR仪（华美，复日等） 现在以半导体（Peltier板）制冷式为主（杭州博日,上海天呈, 厦门安普利等）,1. 水浴式PCR基因扩增仪,水浴式PCR基因扩增仪一般由三个不同温度的水浴槽和机械臂组成，样品管分别浸于三个水浴槽中，完成变性、复性和延伸三个过程，反应管在每个槽中停留的时间和槽间移动通过微电脑及其控制的机械臂完成。 该仪温度可调、恒温精度高、温度均匀，价格低廉，适用于基层实验室使用，但机械臂易出故障，水浴槽中水份易蒸发（覆盖矿物油可防止蒸发），体积较大。 国内生产厂家有：华美生物工程公司(ZW1型)，北京新技术研究所（1109型），天津第二医学院(TE1型)，中科院遗传研究所（PCR90A型），上海复旦生物技术所（FR800型）等。此外还有一类水浴式PCR仪，只有一个固定样品槽，通过微机控制将不同温度的水泵入或排出达到温度控制完成DNA扩增的目的，此类型的PCR仪应用较少。,2. 气流式PCR基因扩增仪,气流式PCR仪主要由对流恒温箱（机壳）、热气源、冷气源、控制器等组成，将样品管置于对流恒温箱中，由控制器控制热空气枪、热辐射源和大功力风扇，以提供冷热空气，变换反应管的温度。 该仪的成本低，整个系统没有液体流动，安全度高。 国内生产厂家有：军事医学科学院（PTC51B型、JK232B型），上海复生公司（FS318和818型）；国外有美国安普科技中心1605型毛细管气流式PCR扩增仪。,3. 金属模块式PCR基因扩增仪,此类扩增仪的核心为铝或不锈钢加热块，上面分布数量不等的样品管孔，采用电阻加热、压缩机制冷、半导体调制温度或电子调制温度。 该机体积小，升降温速度快，样品基座温度准确、均一度高，自动化程度高，扩增程序容量较大，检测样品数目多，可用于普通0.5ml管、薄壁管DNA扩增和原位DNA扩增。操作简单、方便，检测结果稳定可靠性高，但价格比较昂贵，适宜于大型综合性科研机构或诊断、检疫单位使用。是目前国内外生产和使用较为普遍的PCR基因扩增仪。 国内外生产厂家主要有美国PE公司（PT系列）、MJ公司（PCT系列）、Ericomp公司（TCX系列）等等，英国Techne公司MW1型，珠海黑马医学仪器公司（Hema 480型），西安康怡公司CY系列，南京桑利司（SL1型），军事医学科学院（JK236B型）和中科院遗传研究所（PCR90B型）等。,PCR仪的种类总体来说可以分为两大类：PCR扩增仪和实时荧光定量PCR仪，普通的PCR扩增仪又衍生出带梯度PCR功能的梯度PCR仪、和带原位扩增功能的原位PCR仪等等。1996年由ABI公司首先推出将扩增和检测融为一体的实时荧光定量PCR仪，此后很多公司如Eppendorf、ROCHE、Corbett、MJ等等都先后推出不同款式的定量PCR仪。,7500型实时定量PCR仪,7500型实时定量PCR仪是特异性靶基因检测与定量的一体化平台。7500将PCR热循环，荧光检测和各种应用分析软件结合在一起，可以动态观察PCR每一循环各反应管中PCR扩增产物逐渐增加的情况。PCR实验结束后可以马上得到定量结果，无需凝胶电泳分析，无需纯化PCR产物，无需进行任何实验操作。7500型实时荧光定量PCR仪采用96孔反应板或单个及8联管，反应体积25-100微升，实验可以在不到2小时内结束。,与其他人工基因定量分析方法如Northern blotting or RNase-protection assays相比，7500型实时荧光定量PCR系统具有时间省，灵敏度高，准确性好和线性范围宽等优点。7500型实时荧光定量PCR系统由全球实时定量PCR技术的领导者美国