GB-T19563-2004大豆种子品种鉴定实验方法简单重复序列间区法.pdf

I C S 6 5 . 0 2 0 . 0 1一一B 21翰黔中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准 G B J T 1 9 5 5 3 - - 2 0 0 4 大豆种子品种鉴定实验方法 简单重复序列间区法 E x p e r i me n t a l i d e n t i f i c a t i o n me t h o d f o r v a r i e t y o f s o y b e a n s e e d -I S S R2 0 0 4 - 0 6 - 2 2发布2 0 0 4 - 1 2 - 0 1 实施 率 督骡 臀 瓣 譬 篷 臀 臀暴 发 “免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载 G B / T 1 9 5 6 3 -2 0 0 4 前 下翎本标准的附录 A为规范性附录。本标准由国家质量监督检验检疫总局提出。本标准起草单位： 国家农业标准化监测与研究中心（ 黑龙江） 、 黑龙江省质量技术监督局。本标准主要起草人： 王庆贵、 徐晶、 姜雯、 李光宇、 石绍业、 郝兆军。标准下载网()免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载G B / T 1 9 5 6 3 -2 0 0 4 引言 目前， 我国农作物种子的鉴定多采用种植鉴定、 快速测定法 （ 苯酚染色法 、 大豆种皮愈创木酚染色法、 高粱种子氢氧化钾一 漂白粉测定法、 燕麦种子荧光测定法、 小麦种子氢氧化钾测定法） 、 聚丙烯酞胺凝胶电泳法测定大麦、 小麦种子纯度等。这些方法所需的检验周期较长， 虽然电泳法所需时间短， 但不具备分子水平鉴定的诸多优点 。 随着分子生物学的发展 ， 特别是 2 0 世纪 9 0 年代以来 ， 分子生物学的相关技术已被广泛应用 ， 其检测对象为D N A大分子生物的遗传基础。以D N A为检测对象， 具有许多其他检测水平所不具备的优点： 首先， 可供探测D N A标记的数量是无限的， 这是同工酶技术所无法比拟的； 其二， D NA分析技术不像其他技术那样随组织或发育阶段而异 ， 植物体任何部位、 任何时期提供的 D N A均可用于分析， 其检测结果都是一样的； 第三 ， D N A分析不受环境影响 ， 其变异只源于等位基因 D N A序列的变异 ， 这种稳定性便于揭示品种间的遗传变异 ， 从而排除了环境变异所造成的表型变异 。 基于上述优点 ， D N A分析技术是农 、 林、 牧 、 渔等品种鉴定的先进方法。标准下载网()免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载 G B / T 1 9 5 6 3 -2 0 0 4 大豆种子品种鉴定实验方法 简单重复序列间区法， 范围 本标准规定了大豆种子品种鉴定的实验方法。 本标准适用于利用简单重复序列间区（ I S S R ） 法对大豆种子品种鉴定的实验过程。2 术语、 定义和缩略语2 . 1 术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。2 . 1 . 1 聚合酶链式反应 p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n 少至一个拷贝的特定碱基顺序的 D NA片断在体外花费几个小时即可扩增 出数百万个分子的酶催化反应， 即D N A合成反应。2 . 1 . 2 简单皿复 序列间区 i n t e r - s i m p l e s e q u e n c e re p e a t 是在P C R技术基础上发展起来的一种分子标记和检测方法， 根据某个简单重复序列（ 微卫星位点）设计出一系列特异引物， 通过P C R反应扩增微卫星位点间隔的碱基顺序， 以检测其扩增片段长度的多态性。2 . 1 . 3 徽卫星 D N A m i c ros a t e l l i t e D N A 是一类 由几个核昔 酸（ 一般为 1 个 5 个） 为重复单位 的长 达几 十至几百个核昔酸的串联重复序列。2 . 1 . 4 核昔酸n u c l e o t i d e 是构成核酸的基本单元， 由三部分组成： 五碳糖、 磷酸和环状的含氮碱基2 . 1 5 引物p r i m e r 一条互补结合在模板D N A链上的短的 单链， 提供3 - O H末端作为D N A合成的起点， 延伸合成模板 D N A的互补链 。2 . 1 . 6 引 物扩增多 态性 p r i m e r a m p l i f i e d 州y m o r p h i s m 一对引物在两个或两个 以上不 同材料基 因组 D N A之间扩增 ， 得到数 目不同或长度不同的 D N A片断。2 . 2 缩略语 下列缩略语适用于本标准。 I S S R 简单重复序列间区（ I n t e r -S i m p l e S e q u e n c e R e p e a t ) P C R 聚合酶链式反应（ P o l y m e r a s e C h a i n R e a c t i o n ) D N A 脱氧核糖核酸（ D e o x y r i b o n u c l e i c A c i d )标准下载网()免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载G B / T 1 9 5 6 3 - 2 0 0 4 R N A核糖核酸（ R ib o n u c le i c A c i d ) O D光密度（ O p t ic a l D e n s i t y ) T B E 三经基氨基甲烷一 硼酸一 乙二胺四乙酸二钠（ T r i s B o r ic - a c i d E D T A)3 实验方法3 . 1 原理 D N A是生物体的遗传基础 ， 携带所有的遗传物质 ， 从 D N A分子水平上进行鉴别是区分物种 、 品种甚至个体之间差异最为有效的方法。 利用P C R技术可将D N A片段在短时间内扩增几十甚至几百万倍， 从而达到可以检测的目的。I S S R 方法是在P C R技术基础上发展起来的一种检测方法， 是根据简单重复序列（ 微卫星位点） 设计出一系列特异引物， 包括双核昔酸、 三核昔酸和四核昔酸等为重复单位的微卫星D N A片段（ 一般为2 0 个碱基） ， 通过P C R反应扩增微卫星位点及其间隔区， 以检测其扩增片段的多态性。3 . 2 环境条件 a ） 温度： 1 5 0C - 2 5 0C； b ) 湿度： 相对湿度（ R H） 不大于 5 0 0 0 03 . 3 仪器 a ) P C R扩增仪； b ) 紫外分光光度计； c ） 高速台式离心机： 转速不小于1 5 0 0 0 r / m i n ; d ) 多用 电泳仪及水平式电泳槽 ； e ) 紫外透射仪； f ) 微量移液器： 规格为0 . 1 p .L - 2 . 5 p .I _ , 2 ji L - 2 0 f A L , 2 0 ju L -2 0 0 ji L , 1 0 0 L L -1 0 0 0 p L ; g ） 电子天平： 分度值为。 . 0 0 0 1 g ; h ) 磁力加热搅拌器； i ) 凝胶成像系统； j ） 超纯水系统； k ） 灭菌锅； 1 ) 酸度计： 最大允许误差为士0 . 1 p H; m） 微波炉 ； n ） 恒温水浴锅 ： 最大允许误差为士1 0C ; a ) 恒温干燥箱 ： 最大允许误差为士1 0C o3 . 4 试剂和耗材3 . 4 . 1 试剂 a ) T a g D N A聚合酶： 保存条件为一2 0 士2 0C； b ) 1 0 X B u f f e r ： 保存条件为一2 0 土2 0C； c ） 四种脱氧核昔酸（( 4 X d N T P ) ： 保存条件为一2 0 士2 1C; d ) Mg t 十： 保存条件为一2 0 士2 0C； e ) R N A酶（ 无 D N A酶） ： 保存条件为一2 0 士2 0C； f ） 琼脂糖（ a g a r o s e ) ； g ） 三经甲基氨基甲烷（ T r i s ) ： 分子式为C , Hn N O , ; h ） 乙二胺四乙酸二钠（ E D T A N a t 2 H 2 0) ： 分子式为 C i o Hi a N Z O a N a t . 2 H 2 O; i ) 澳酚蓝（ b r o m p h e n o l b l u e s o d i u m s a l t ) ： 分子式为C , 9 Hg B r , 0 5 S N a ; 7 ） 二甲苯青F F ( x y l e n e c y a n o l e F F ) ： 分子式为C 2 s H2 7 N 2 0 6 S 2 N a ;标准下载网()免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载 G B / T 1 9 5 6 3 -2 0 0 4 k ) 8 - 经基哇琳( h y d r o x y q u i n o li n e ) ： 分子式为C , H, N O; 1 ） 十二烷基磺酸钠（ S D S ) ： 分子式为C 1 2 H 2 5 0 , S N a ; m) 澳化乙锭( E B ) ： 分子式为C 2 1 H 2 o N 3 B r ; n ） 异戊醇： 分子式为C , H l , O H; 0 ） 结晶酚( p h e n o l ) ： 分子式为C , H , O， 保存条件为一2 0 士2 0C; P ） 三抓甲烷： 分子式为 C HC 1 3 ， 纯度为分析纯； q ) 硼酸（ b o r i c a c id ) ： 分子式为H 3 B 0 3 ， 纯度为分析纯； r ） 蔗糖（ s u c r o s e ) ： 分子式为C 1 2 H 2 2 0 1 1 ， 纯度为分析纯； s ) 无水乙醉： 分子式为 C Z H , OH， 纯度为分析纯 ； t ) 盐酸： 分子式为 HC 1 ， 纯度为分析纯 ； u ) 抓化钠 ： 分子式为 N a C l ， 纯度为分析纯； v ) 水： 分子式为H 2 O。本实验所用水均为去离子水。3 . 4 . 2 耗材 a ) 离心管： 规格为1 . 5 m L , O . 2 m L 。使用前需进行高压灭菌（ 按第凡1 章中规定的方法进行操作） ； b ） 研钵： 规格为直径 7 c m -1 0 c m; c ) 移液器吸头： 规格为2 0 ti L , 2 0 0 p .L和1 0 0 0 p L 。使用前需进行高压灭菌； d ） 容量瓶： 规格为1 0 0 mL , 1 0 0 0 mL ; e ） 烧杯： 规格为1 0 0 mL ; f ) 三角烧瓶 ： 规格为 2 5 0 m L ; g ) P E手套； h ） 锡箔纸； i ） 封 口膜。3 . 5 实验程序3 . 5 . 1 D N A的提取3 . 5 . 1 . 1 取大豆种子半粒， 放在1 . 5 m L离心管中， 加人1 0 0 0 p .L匀浆缓冲液（ 按第a2 章中规定的方法进行配制） 浸泡4h ， 倒人研钵中充分研磨， 将研磨产物倒人1 . 5 m L离心管中， 取少量匀浆缓冲液冲洗研钵， 一并倒人离心管中， 离心（ 转速为 4 0 0 0 r / m i n ) 1 0 m i n ， 将上清液移至新的 1 . 5 m L离心管中， 弃沉淀。3 . 5 . 1 . 2 加人与上清液等体积的饱和酚（ 按第A. 3 章中规定的方法进行配制） ， 缓慢颠倒离心管2 0 m i n ， 避免剧烈振荡。3 . 5 . 1 . 3 离心（ 转速为8 0 0 0 r / m i n ) 1 0 m i n ， 将上清液移至新的离心管中。3 . 5 . 1 . 4 加人与上清液等体积的酚一 三氛甲烷一 异戊醇（ 体积比为2 4， 2 3 ， 1 ) ， 离心（ 转速为8 0 0 0 r / m in )1 0 min ， 将上清液移至新的离心管中。3 . 5 . 1 . 5 加人与上清液等体积的三氛甲烷一 异戊醇（ 体积 比为 2 3， 1 ) ， 缓慢颠倒 1 0 m i n ， 离心（ 转速为8 0 0 0 r / m i n ) 1 0 m i n ， 取上清液至新的离心管中。3 . 5 . 1 . 6 加人上清液二倍体积的冰冷乙醉， 水平旋转离心管5 0 圈1 0 0 圈， 即可出现白色絮状D N A,3 . 5 . 1 . 7 将离心管置于一2 0 冰箱中3 0 m in ， 取出后离心（ 转速为8 0 0 0 r / m in ) 1 0 m i n ， 形成白色沉淀。3 . 5 . 1 . 8 倒掉离心管中的液体， 加人1 mL 7 5 乙醇， 离心（ 转速为1 5 0 0 0 r / min ) 5 mi n ， 倒掉乙醉， 倒置在干净的吸水纸上， 吸干液体 。3 . 5 . 1 . 9 将离心管置于恒温干燥箱（ 4 0 0 C -5 0 0C） 中2 0 m i n 或里于通风处4 0 m i n ， 使乙醉挥发。3 . 5 . 1 . 1 0 加人1 0 0 p L T E缓冲液（ 按第A . 4 章中规定的方法进行配制） 和R N A酶2 K L （ 按第A . 5 章中规定的方法进行配制） ， 水浴（ 5 5 士2 0C ) 1 2 h ， 使D N A沉淀充分溶解， 4 冰箱中保存。免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载G B / T 1 9 5 6 3 -2 0 0 43 . 5 . 2 D N A浓度的检测3 . 5 . 2 . 1 策外吸收检测 D N A分子中的嗦吟环和啥陡环能够吸收紫外光。D N A的紫外吸收高峰在波长 2 6 0 n m处 ， 蛋 白质的紫外吸收高峰在波长2 8 0 n m处。取3 . 5 . 1中提取的D N A溶液5 p L ， 加水9 9 5 I .L ， 放人比色杯中， 用紫外分光光度计检测， 记下2 6 0 n m和2 8 0 n m下的O D值， 计算出D N A的浓度以及O D 6 。 和O D a o的比值。D N A的O 玖6 o / O D z a o 最好在 1 . 8 左右， 1 . 5 以上也可用于I S S R - P C R分析， 若比值太小应重复3 . 5 . 1 . 2 3 . 5 . 1 . 1 0 步骤继续抽提。 D NA浓度按公式（ 1 ) 计算 ： D 二 5 0 X 1 0 0 0 X O D 1 60 X s （ 1 ） 式中： D -D N A的浓度， 单位为纳克每微升（ n g 加L ) ; s 稀释倍数。3 . 5 . 2 . 2 凝胶电泳检测 将制备好的浓度为0 . 7 的琼脂糖凝胶（ 按第A . 6 章中规定的方法进行配制） 放人电泳槽中， 使点样孔处于电源负极端， 加人恰好没过胶面1 m m深的足量电泳缓冲液（ 0 . 5 XT B E ) ( 按 A . 6 . 3中规定的方法进行配制） 。 取D N A溶液1 0 K L 和凝胶加样缓冲液（ 按第A . 7 章中 规定的方法进行配制）) 2 tA L ， 在封口膜上用微量移液器上下吸打混匀， 加人到点样孔中（ 注意避免出现气泡） 。打开电源， 将电压控制在5 V / c m， 电泳1 h ， 取出凝胶， 放在紫外透射仪上观察。若D N A质量好、 分子量高( 5 0 k b ) 且无降解，在点样孔附近呈现一条致密亮带； 若D N A部分降解， 则呈连续分布状态； 若严重降解， 则看不到大片段D N A， 只能在远离加样孔的地方看到 R N Ao3 . 5 . 3 I S S R扩增3 . 5 . 3 . 1 反应成分 2 5 p .L反应体系中， 含有 1 X B u f f e r , l . 5 m m o l / L Mg 2 + , 2 0 0 ) .mo l / L d N T P , 1 U T a g D N A聚合酶，1 li m o l / L 引物， 1 0 0 n g 模板D N A， 加水至2 5 f .L （ 各反应成分的配制按第A . 8 章中规定的方法进行） 。按上述比例将反应液依次加人0 . 2 mL离心管中， 放人P C R仪中， 进行P C R循环。3 . 5 . 3 . 2 循环过程 循环过程如图 1 所示 ： 9 4 C 预变性7 m i n 9 4 C 变性3 0 s一 4 8 退火4 5 s ( 4 5 个循环 7 2 1 C 延伸6 0 s 一 一一 J 7 2 C廷伸7 m i n 4 C冷却 圈 1 P C R反应循环过程示意圈3 . 5 . 3 . 3 电泳检测 将制备好的浓度为2 的琼脂糖凝胶（ 按第A . 6 章中规定的方法进行配制） 放人电泳槽中， 使点样孔处于电源负极端。取P C R扩增产物1 0 IA L和凝胶加样缓冲液（ 按第A . 7 章中规定的方法进行配制）2 t i L ， 在封口膜上用微量移液器上下吸打混匀， 加人到点样孔中。打开电源， 将电压控制在3 V / c m， 电泳4h ， 切断电源， 取出凝胶， 在凝胶成像上扫描。3 . 5 . 3 . 4 鉴定 将待测品种的凝胶成像结果与该品种原种的标准谱带相 比较， 从而鉴定出该品种的真实性 。免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载 G B / T 1 9 5 6 3 -2 0 0 4 附录A （ 规范性附录） 灭菌方法及缓冲液和主要试剂的配制A . 1 商压灭菌的操作方法 将欲灭菌的离心管放人烧杯中， 用锡箔纸封 口； 移液器吸头装在吸头盒内， 配好的试剂装人试剂瓶中， 盖好盖， 放人灭菌锅中。首先将压力升至1 P a ， 放气， 再将压力重新升至1 P a ， 开始计时， 2 0 m i n 后，将电源关闭。待压力为零时， 取出离心管、 吸头及试剂瓶， 待用。A . 2 匀浆级冲液的配制 取1 mo l / L T r i s C l ( P H 8 . 0 ) 2 0 0 mL , 0 . 5 m o l / L E D T A( p H8 . 0 ) 5 0 m L和0 . 5 g S D S ， 加水至1 0 0 m L 。使用前应保证S D S 充分溶解， 若出现结晶， 应放在5 0 水浴中溶解1 0 m i n ,A . 2 . 1 1 mo l / L T r i s C l ( P H8 . 0 ) ： 称取1 2 . 1 1 g T r i s , 溶于8 0 mL水中， 用浓 H C l 调节溶液的p H值至8 . 0 ， 加水定容至1 0 0 m L ， 高压灭菌。A . 2 . 2 0 . 5 m o l / L E D T A ( p H 8 . 0 ) ： 称取1 8 . 6 1 g E D T A N a 2 2 H2 0, 溶于8 0 m L水中， 在磁力加热搅拌器上剧烈搅拌， 用N a O H（ 约需2g 左右） 调节溶液的p H值至8 . 0 ， 加水定容至1 0 0 mL ， 高压灭菌。A . 3 饱和酚的制备 饱和酚的制备宜在通风橱或通风良好的条件下进行。A . 3 . 1 将室温下的酚置于6 0 水浴中融化， 然后倒人蒸馏器中加热， 在1 8 0 左右搜集液体。经重蒸的酚分装贮存于一2 0 冰箱中备用 。A . 3 . 2 将重蒸酚 6 0 水浴中融化后， 加人 8 - 经基哇琳达到终浓度0 . 1 0 o ， 加人等体积0 . 5 m o l / LT r i s C l ( P H8 . 0 ) 溶液， 用磁力加热搅拌器混匀后静止一段时间， 移出上层水相， 重复此过程， 直到酚相的p H值大于7 . 8 时， 即为饱和酚溶液， 装人棕色瓶中， 4 冰箱中贮存。A . 4 T E缓冲液的配制 取1 mo l / L T r i s C l ( p H7 . 6 ) 1 mL , O . 5 m o l / L E D T A ( p H 8 . 0 ) 0 . 2 M L ， 加水至1 0 0 m L ,A . 4 . 1 1 mo l / L T r i s C l ( P H 7 . 6 ) ： 称取1 2 . 1 1 g T r i s ， 溶于8 0 m L水中， 用浓 H C l 调节溶液的p H值至7 . 6 ， 加水定容至1 0 0 m L ， 高压灭菌。A . 4 . 2 0 . 5 m o l / L E D T A( p H 8 . 0 ) ： 同 A . 2 . 2 。A . 5 R N A醉( 1 0 m g / m L ） 的配制 称取R N A酶1 m g , 溶于1 0 0 p L T E缓冲液中， 水浴（ 7 0 C ) 1 0 mi n ， 缓慢冷却至室温。A . 6 琼脂精凝胶的配制 配制浓度为0 . 7 %（ 或2 %） 的琼脂糖凝胶需称取琼脂糖0 . 7 g （ 或2g ） 置于2 0 0 mL三角瓶中， 溶于1 0 0 mL 0 . 5 X T B E中， 在微波炉中溶化至溶液透明， 冷却至5 0 C-6 0 C， 加人澳化乙锭（ 1 0 m g / mL ) ， 调至终浓度为0 . 5 p g / mL ， 混匀后将凝胶倒人已封口并放好梳子（ 距底板1 . 0 m m左右） 的载胶板上， 凝胶厚度在 3 m m-5 mm为宜， 待凝胶完全凝固后放人电泳槽中备用。A . 6 . 1 澳化乙锭（ E B ) 贮液（ 1 0 m g / m L ) ： 称取 1 g 澳化乙锭 ， 溶于 1 0 0 mL水 中， 用磁力加热搅拌器搅拌数小时以确保其完全溶解， 移至棕色瓶中， 4 冰箱中保存。免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载G B / T 1 9 5 6 3 -2 0 0 4A . 6 . 2 5 X T B E ： 称取5 4 g T r is ， 溶于8 0 0 mL水中， 加人2 0 m L 0 . 5 m o l / L E D T A( p H 8 . 0 ） 和2 7 . 5 g硼酸， 定容至1 0 0 0 mL ， 高压灭菌， 贮存于室温。A . 6 . 3 0 . 5 X T B E ： 称取5 X T B E 1 0 0 m L ， 加水定容至1 0 0 0 m L ， 备用。A . 7 凝胶加样级冲液 0 . 2 5 %澳酚蓝、 0 . 2 5 二甲苯青F F , 4 0 %（ 质量浓度） 蔗糖水溶液。A . 8 反应体系中各反应成分的配制A . 8 . 1 1 U T a g D N A雄合醉 2 5 p .L反应体系中需加人T a g D N A聚合酶体积按公式（ A . 1 ) 计算： 1 V 去 ” ” ” ” ， 。 ” （A, 1） D 式中： V T a g D NA聚合醉的体积， 单位为微升（ p .L ) ； D T a g D N A聚合醉的 浓度， 单位为单位每微升（ U / FA L ) oA . 8 . 2 1 . 5 m m o l / L M扩 2 5 K L反应体系中需加人Mg z . + 体积按公式（ A . 2 ) 计算： 1 . 5 X 2 5 V 二 二二井二： ” ” ” 一 （A. 2） D、 ， 式中： V Mg z 的体积， 单位为微升（ ju L ) ; D - Mg ， 十 的 浓度， 单位为毫摩尔每升（ m m o l / L ) ,A . 8 . 3 1 0 p m o l / L引物 首先将引物离心， 然后加水稀释。加水体积按公式（ A . 3 ) 计算， 放在一2 0 冰箱中保存， 每次使用前 用 水稀 释三 倍， 终浓 度即 为1 0 p .m o l / L , O D 。 X 3 3 V 二 兰 冬拌侧 书子 二， “ ” ” ” “ “ ” 二 “ “ （A. 3） M 又 1 0 其 中公式（ A . 3 ) 中 M 的计算按公式（ A . 4 ) 进行 ： M n A X 3 1 3 . 2 2 - - n G X 3 2 9 . 2 2 十 n C X 2 8 9 . 1 9 - I- n T X 3 0 4 . 1 9一6 1 . 9 7 二 ， （A . 4） 式 中： V 一加水体积， 单位为微升（ K L ) ; M引物分子量， 单位为克每毫升（ g / m L ) ; n碱基数 ， A腺嗦吟（ a d e n i n e ) ； G 鸟嗦吟( g u a n i n e ) ； C 胞心陡( c y t o s i n e ) ， T 胸腺啥吮( t h y m i n e ) 。免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载 G B / T 1 9 5 6 3 - - 2 0 0 4 参考文献 1 J . 萨姆布鲁克， E . F 弗里奇， T . 曼尼阿蒂斯， 分子克隆 北京： 科学出版社， 1 9 9 6 2 B e n j a m i n L e v w i n . G e n e s V I N e w Y o r k : O x f o r d U n i v e r s i t y P r e s s , 2 0 0 0 3 B l a i r . M. W. ， O . P a n a u d , S . R . Mc C o u c h . I n t e r - s imp l e s e q u e n c e r e p e a t US S R ) a m p l i f ic a t io n f o r a n a l y s i s o f mic r o s a t e l l i t e m o t i f f r e q u e n c y a n d f i n g e r p r i n t i n g i n r i c e ( O r y x a s a t i v a L . ） T h e o r A p p l G e n e t 9 8 ， 1 9 9 9 . 7 8 0 -7 9 2 4 D a v is . J . L . ， D . L . C h il d e r s , D . N . K u h n . C l o n a l v a r ia t io n i n a F l o r i d a B a y T h a l a s s ia t e s t u d i - n u m m e a d o w: m o l e c u l a r g e n e t i c a s s e s s m e n t o f p o p u l a t i o n s t r u c t u r e . Ma r E c o l P r o g S e r 1 8 6 ， 1 9 9 9 . 1 2 7 - 1 3 6 . 5 F a n g . D . Q . ， R . R . K r u e g e r , M. L . R o o s e . P h y l o g e n e t i c r e la t i o n s h i p s a m o n g s e l e c t e d c i t r u s g e r m p l a s m a c c e s s io n s r e v e a l e d b y i n t e r - s im p l e s e q u e n c e r e p e a t ( I S S R ) m a r k e r s . J A m S o c Ho r t S c i 1 2 3 ， 1 9 9 8 . 6 1 2 -6 1 7 6 G e . X . J . ， M. S u n . R e p r o d u c t i v e b i o l o g y a n d g e n e t i c d i v e r s i t y o f a c r y p t o v i v i p a r o u s ma n g r o v e A e g i c e r a s c o r n i c u l a t u m ( My r t l n a c e a e ) u s i n g a ll o z y m e a n d i n t e r s i m p l e s e q u e n c e r e p e a t O S - S R ) a n a l y s i s . Mo l . E c o l . 8 ， 1 9 9 9 . 2 0 6 1 -2 0 6 9 7 G o d w i n . 1 . D . , E . A . B . A i t k e n , L . W. S m i t h . A p p l i c a t io n o f i n t e r - s i m p l e s e q u e n c e r e p e a t ( I S - S R ) m a r k e r s t o p l a n t g e n e t ic s . E l e c t r o p h o r e s i s 1 8 , 1 9 9 7 . 1 5 2 4 1 5 2 8 8 Hu a n g . J . ， S . M. G e n e t i c d i v e r s i t y a n d r e l a t i o n s h ip s o f s w e e t p o t a t o a n d i t s w i ld r e l a t iv e s in I p o m o e a s e r i e s B a t a t a s ( C o n v o l v u l a c e a e ) a s r e v e a l e d b y i n t e r - s imp l e s e q u e n c e r e p e a t U S S R ) a n d r e s t r i c t io n a n a l y s i s o f c h l o r o p l a s t D N A . T h e o r A p p l G e n e t 1 0 0 , 2 0 0 0 . 1 0 5 0 -1 0 6 0 9 K o j i m a . T . ， T . N a g a o k a , K . N o d a , e t a l . G e n e t i c l i n k a g e ma p o f I S S R a n d R A P D m a r k e r s i n E in k o r n w h e a t i n r e l a t i o n t o t h a t o f R F L P m a r k e r s . T h e o r . A p p l . G e n e t . 9 6 ， 1 9 9 8 . 3 7 -4 5仁 1 0 P r e v o s t , A . , M. J . Wi lk i n s o n . A n e w s y s t e m o f c o m p a r i n g P C R p r i m n e r s a p p l ie d t o I S S R f in - g e r p r i n t i n g o f p o t a t o c u l t iv a r s . T h e o r A p p l G e n e t 9 8 ， 1 9 9 9 . 1 0 7 -1 1 2 1 1 R a t n a p a r k h e . M. B . ， M. T e k e o g l u , F . J . Mu e h l b a u e r . I n t e r s i m p l e s e q u e n c e r e p e a t（ I S S R ) p o l y m o r p h i s m s a