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文档简介

,细,胞,冻,存,目录,什么是细胞冻存,细胞冻存的好处,细胞冻存的关键因素,细胞冻存的操作流程,一,什么是细胞冻存,细胞冻存是细胞保存的一种方法，是将细胞放在低温环境（-196），以便长期储存的一种技术。,低温环境下，细胞酶的活性降低，新陈代谢减少，细胞生命活动几乎处于静止状态，从而达到长期保存细胞的目的。,不止有速度，温度也可跑赢时间,二,细胞冻存的好处,细胞培养过程中需要细胞培养人员定期进行换液、传代等操作，此过程需要耗费大量培养基、培养瓶等试剂耗材。,不冻存,冻存,处于细胞冻存状态的细胞不需要进行操作。,VS,细胞培养操作过程中，由于人为、环境等因素，会存在微生物污染的风险。,不冻存,冻存,处于细胞冻存状态的细胞，污染风险大幅降低。,VS,细胞一旦开始体外培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。,不冻存,冻存,处于细胞冻存状态的细胞，生命活动几乎处于静止状态，生物学特性与冻存前相比不会发生变化。,VS,细胞冻存节省了大量人力物力。,降低了细胞种子丢失的风险。,三,细胞冻存的关键因素,2、冷冻速率,1、保护剂,保护剂,保护剂是细胞冻存时加入到细胞中的一种试剂， 该试剂的存在能有效保护细胞免收冻存过程中产 生的冰晶损伤和电解质损伤。,形成冰晶，电解质浓度的增大是冻存时细 胞损伤的主要原因。,根据是否能穿过细胞,渗透性保护剂,非渗透性保护剂,一般为小分子物质，如甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。其原理为：渗透到细胞内，在细胞内外产生一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液的电解质浓度，防止电解质损伤。,一般为大分子物质聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羟乙基淀粉等。其原理为：这些大分子物质可以优先同溶液中的水分子结合降低自由水含量，从而减少冰晶的形成，同时分子量大，溶液中的电解质浓度也相应降低，从而减少了电解质损伤。,冷冻速率,缓冻速溶，降温速率一般在-1-2/min。,温度下降过程中，细胞外溶液先出现结冰，细胞内水分外流。若冷冻速率过快，细胞内水分来不及外流形成冰晶损伤细胞；若冷冻速率过慢，细胞严重脱水皱缩，超过一定程度会失去活性。,一般情况而言，-5时由于有保护剂存在细胞内外溶液未结冰；-5-15溶液开始结冰；-25时细胞内外溶液全部结冰。-25以后可适当增加降温速率。,04,细胞冻存的操作流程,细胞的冻存应在无菌环境严格按照无菌操作进行。 配制细胞冻存液并放入4预冷。实验室常用的冻存液为10%DMSO 90%血清；或10%DMSO、40%培养基 、50%人血白蛋白。 收集细胞并计数：贴壁细胞需胰酶消化后离心收集细胞；悬浮细胞可直接离心收集细胞。 用冻存液重悬细胞，将细胞悬液分装到冻存管中。 将细胞缓慢降
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