2014年09月18日细胞培养平台课.ppt

细 胞 与 组 织 培 养 技 术,李 呼 伦 哈尔滨医科大学神经生物学教研室 2014.09.18,前 言,组织培养技术的应用,基础研究 工业化生产,Park IH, et al. Cell. 2008 Sep 5;134(5):877-86.,病毒组织培养疫苗生产,基因工程产品,层析 和 超滤,分离、浓缩生物大分子 常用的手段,试管婴儿,静止培养,旋转培养,振荡培养,生物反应器高密度培养,厌氧培养,一、细胞培养方式,二、体 外 培 养 的 分 类,体外培养 in vitro 细胞培养 Cell culture 组织培养 Tissue culture 器官培养 Organ culture,体外培养种类,细胞培养 （ Cell culture ）,培养物是单细胞或群体细胞 模拟体内生理环境，在无菌、适当的温度和一定的营养条件下，使之生长生存维持结构和功能的培养方法。,组织培养（Tissue culture）,方法同上，使用组织块(0.5-1mm3)或薄片(0.2mm),器官培养（Organ culture）,应用和组织培养相似的条件，培养的是器官的原基、 器官的一部分或整个器官，使之在体外生存、生长 和保持一定功能的方法 使用器官原基或器官的一部分或整个器宫,三、组织与细胞培养的优缺点,优点： 能长时间直接观察活细胞的形态结构和生命活动；可用于细胞学、遗传学、免疫学、实验医学和肿瘤学等多种学科的研究工作 便于观察、记录、摄影，直接观察细胞变化 可供研究的细胞种类广泛，从低等生物到高等动物，以及人类；从胚胎到成体；从正常组织到肿瘤细胞皆可 便于使用不同方法研究细胞（相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、组织化学和同位素标记等）,培养细胞携带有与体内细胞同等的基因组，是分子生物学和基因工程学的研究对象和组成部分 可同时提供大量生物性状相似的实验对象，耗资少，经济 易于施加物理、化学和生物因素进行实验 已成为生物制品、基因工程制品、单克隆抗体生产的必要手段,局限性： 组织和细胞离体以后，独立生存在人工培养环境中，与体内环境相比，仍有很大差异。故实验结果不能推至体内，轻易做出与体内等同的结论,四、组织与细胞培养的细胞生物学特点,体内外细胞的差异：当人工条件和体内实际情况不完全相同时，细胞在体外培养后，一旦失去神经体液调节和细胞间相互影响，生活在缺乏动态平衡的环境中，发生变化则是必然。细胞最多见的表现是：返祖（Atavism）现象，即失去原有组织结构和细胞形态、分化减弱、细胞趋单一化、不死性、恶性状态。 细胞增殖和分化：是细胞生命进化中所获得的基本属性，增殖使细胞数量增多；分化使机体结构和功能多样化，最后演变成完整的有机体。,五、培养细胞的状态,贴附型 能贴附在支持物表面生长。大多数培养细胞呈贴附性生长；只依赖于贴附才能生长 贴附后，易失去其原有的特征，细胞分化现象常不显著。在形态上表现单一化的现象，并常反应其胚层起源，呈现类似“返祖现象” 成纤维型细胞、上皮型细胞、游走型细胞及多形型细胞 悬浮型,成纤维型细胞 细胞体呈梭形或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状 成纤维细胞 、心肌、平滑肌、成骨细胞、骨髓基质干细胞等,上皮型细胞 扁平不规则多角形，中有圆形核，细胞紧密相连成单层膜 消化管外皮细胞、肝、胰、肺泡上皮、血管内皮等,游走型细胞 在支持物上散在生长，一般不连接成片。细胞质经常伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动，速度快而且不规则 神经胶质细胞,多形型细胞 难以确定其规律和稳定的形态 神经组织细胞,悬浮型 见于各种造血系统肿瘤细胞和血液细胞 胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长 容易大量繁殖,六、培养细胞生长的条件,营养 生存环境 温度: 37 O2 CO2: 5% CO2 +H2O H2CO3 H+ + HCO3- pH: 7.0-7.2 渗透压 无污染 无毒,组织培养室的设施及条件,压力蒸汽消毒器：湿热消毒。用途广 电热干燥箱：干热消毒（160，2小时）。主要用干玻璃器皿消毒 滤器：过滤除菌。大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌 超净工作台：为细胞操作提供无菌环境 紫外灯 ：紫外线消毒。主要用于培养室空气、操作台、塑料培养皿和培养板等表面消毒,七、无 菌 操 作,无菌室的灭菌 定期打扫无菌室 实验前灭菌 实验后灭菌 实验人员的无菌准备 肥皂洗手 穿隔离衣 酒精棉球擦手,无菌操作中常犯的错误,吸管、剪刀等碰到其他器皿,无菌操作中常犯的错误,正确的拿管姿势,错误的拿管姿势,拿吸管时手碰到无菌区,无菌操作中常犯的错误,培养基浸湿吸管底部的棉花,八、细 胞 和 组 织 培 养,将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。 1、组织块培养 直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。 2、细胞培养 一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。,计 数 细 胞,细胞数/ml=计数16格稀释倍数 104,细胞数/ml=计数16格个数/个数稀释倍数104,培养细胞的观察,每隔一定时间观察一次 是否生长良好 形态是否正常 有无污染 培养基的PH是否太酸或太碱（由酚红指示剂指示） 定时检查培养温度和CO2浓度,概 念,原代培养 直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养物。一旦已进行传代培养（Subculture）的细胞，便不再称为原代培养，而改称为细胞系。 传代培养 细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。每传代一次称为“一代”。二倍体细胞一般只能传几十代，而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。,取 材,理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。,细 胞 培 养 的 准 备 工 作,九、原 代 培 养,组 织 块 法,新鲜取材的组织中 细胞仍具有分裂增殖的能力。将组织切成小块培养在模拟体内的环境中，小块组织的细胞可以游离出来，从培养液中吸取营养，继续分裂生长。 组织块培养法适用范围广，常用于肝脏、皮肤、角膜、骨骼、韧带、血管、神经、心脏等器官和组织的培养。,培 养 要 点,材料新鲜 严格无菌操作 剔除脂肪等附着组织 组织块剪小（直径1mm） 摆放开（间距5mm）,常 犯 的 错 误,操作中不换器械 冲洗次数不够 组织碎片太大 组织块摆放太密 培养液加入太多,消 化 培 养 法,消化培养法所用的酶有多种，目前应用最广的是胰蛋白酶。它是一种内切酶，可专一水解有精胺酸或赖氨酸的羧基形成的肽键。从而消除妨碍细胞生长的细胞间质，包括基质、纤维等，使细胞分散，易于贴壁并从外界吸收养分和排除代谢物 。 消化法适用于组织量大的原代培养。胰蛋白酶液适用于消化间质少的组织，如羊膜、胚胎、上皮、肝和肾等组织及传代细胞。,培 养 要 点,组织剪碎至1mm3左右 合适的胰蛋白酶浓度（通常为0.25%） 合适的消化时间：消化时，待组织块变得较疏松，颜色略白为止（通常为37，2040分钟）,常 犯 的 错 误,水浴锅未预热,组织块太大,胰蛋白酶消化不足或过度,吹打用力过重,常 犯 的 错 误,十、传 代 细 胞 培 养,细胞在原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶的操作叫传代。为获得稳定的细胞株，或大量的同种细胞，当培养细胞形成致密的单层后需进行传代培养。,细 胞 传 代 方 法,根据细胞生长的特点，传代方法有3种 悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除l/22/3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代 半悬浮生长细胞传代 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代 贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液,贴壁生长细胞传代方法,吸光培养瓶中的培养液 PBS洗一次 加入12 ml 0.25的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准） 静置210 min（显微镜下动态监测） 吸去胰蛋白酶液，加入培养液 用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液 吸取1/101/40细胞悬液，接种于新的培养瓶内 加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内 将后者放入培养箱中培养,Trypsin消化细胞,未消化细胞,消化的细胞,培 养 要 点,严格的无菌操作 适度消化,细胞培养中需要注意的问题,培养液和培养物的比例：一定浓度的培养液仅能支持一定数量的细胞生长，不能盲目增加每单位体积的细胞浓度 PH：初培养pH应为7.4，培养过程应不低于7.0 培养瓶内的空间：一般培养瓶内培养液与液面上的空间体积之比为1:10,细胞培养中需要注意的问题,容积、深度、表面面积：培养液体积与表面面积的比例为0.20.5ml/cm2。需高浓度氧的，在浅的培养液（2mm）中生长较好；需要低浓度氧的,在深的培养液（5mm）中生长较好。 去除死细胞 温度控制：动物细胞培养对温度波动的敏感性很大。温度低于36.5，细胞生长缓慢；温度高于37.5，细胞存活力降低,十一、细 胞 冻 存 和 复 苏,细胞冻存的意义,细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化,冻存细胞的理论基础,当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶,冻存和复苏的原则,慢 冻 快 融,细 胞 冻 存 方 法,预先配制冻存液： 90%血清 10%DMSO （二甲基亚砜） 取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液，用吸管吹打制成细胞悬液（11065106细胞/ml) 加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期,慢 冻 程 序,标准程序 当温度在-25 以上时，12 /min 当温度达-25 以下时，510/min 当温度达-100时，可迅速放入液氮中 简易程序 将冻存管于4放置1小时，于-20放置1小时， -80放置1小时/通过线绳将装有冷冻管的纱布袋固定于液氮罐罐口（-70），放置1小时，后直接投入液氮中（-196）,细 胞 复 苏 方 法,从液氮中取出冻存管，在3738水浴中快速使其融化（1分钟左右） 5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上 低速离心10分钟 去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞,十二、 ATCC入库细胞要求,培养简历：组织来源日期、物种、组织起源、性别、年龄、供体正常或异常健康状态、细胞已传代数等 冻 存 液：培养基和防冻液名称 细胞活力：融解前后细胞接种存活率和生长特性 培 养 液：培养基种类和名称（一般要求不含抗生素）、血清来源和含量 细胞形态：类型，如为上皮或成纤维细胞等，融解后细胞生长特性 核 型：二倍体或多倍体，标记染色体的有无 无污染检测：包括细菌、真菌、支原体、原虫和病毒等 物种检测：检测同工酶，主要为G6PD和LDH，以证明细胞有否交叉