细胞冻存复苏及腹水制备LM.ppt

一 腹水制备组的主要工作,我们主要制备的腹水有三类： 1，研发性：即小样，要求注射两只小鼠，至少5ml腹水。 2，中 样：从小样里面筛选出来的细胞株，一般要求5只。 3，生产性：供应生产用的腹水。 腹水制备的原则：保质保量！ 对我们的要求：必须要有高度的责任心。,目前，大量生产单抗的方法主要有两种： 1，体外培养法，从上清中获取单克隆抗体 （1）悬浮培养法： 和常规静置培养相比，增加了细胞生长空间，使单位体积内细胞数量增多，从而增加抗体量。 （2）固相培养法： 单层培养和悬浮培养的结合，主要用于贴壁性较强的杂交瘤细胞，以小的固体颗粒作为细胞生长的载体，细胞固定在载体表面生长。 体外培养法优点：工艺简单，易于控制，目前上市的单抗多用此法。 体外培养法缺点：抗体浓度低，一般含量为200500g左右。,二，为什么要制备腹水？,2. 动物体内诱导法 （1）实体瘤法： 将对数期细胞按(13)107个/ml接种于小鼠背部皮下，多点注射，待肿瘤达到一定大小后可采血获得抗体，一般110mg/ml，缺点是采血量有限。 （2）腹水制备法： 腹水抗体的浓度达25 mg/ml，一般可以抽取5ml左右腹水。 该法优点：操作简单、经济，是一般用途单克隆抗体制备的首选方法，一般用于生产科研或诊断用的单克隆抗体。,三，腹水产生的原因： 1，杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔后，大量肿瘤细胞在腹腔中生长，分泌很多刺激性的因子，胶体渗透压升高，导致腹水产生。 2，杂交瘤细胞的生长对腹膜是个刺激，引起炎症反应导致腹膜上的毛细血管通透性增加，体液漏出，形成腹水 。,四，液体石蜡的作用： 1，免疫抑制剂，注射石蜡油（降植烷和不完全福氏佐剂） 可以降低小鼠的免疫力， 从而降低小鼠对接种的杂交瘤细胞的排斥反应； 2，石蜡（降植烷、不完全福氏佐剂）可以强烈刺激小鼠产生白细胞介素6（IL6），IL6是最重要、最主要的浆细胞（成熟的抗体分泌细胞）生长因子，因此注射上述几种物质都可以通过刺激IL6的产生，为接种的杂交瘤细胞提供较好的生存环境并促进腹水的形成。,注射液体石蜡注意事项： 1，拿小鼠姿势正确，不要被咬伤。 2，不要将针头对着其他人。 3，石蜡不能注射到皮下。 4，注射石蜡时要注意石蜡的量（0.5ml）。 5，发现不同性别小鼠时要将其分开。 6，注射完毕后要及时做好标记。 7，发现缺水少食时应及时提醒添加。,第二章，细胞的复苏 一，确定复苏的细胞数 二，制备适量的饲养细胞 三，细胞的复苏 四，细胞复苏的注意事项,一，首先确定复苏的细胞数 1，比较紧急的项目 对于研发性腹水一般要先和领导沟通确定哪些项目紧急，紧急的项目要随时准备复苏。例如，目前紧急的有肿瘤系列细胞如CA153CR，CA724，colo205等。中样腹水一般由领导直接下单子。 2，根据实际情况自行安排 一般按项目进行复苏，先紧同一个项目复苏，切忌不要同时复苏多个项目，这样容易弄乱，并且交接时比较麻烦。,二，制备适量的饲养细胞 确定完复苏的细胞数量后就要准备饲养细胞，一般一只小鼠的饲养细胞可以配置100mlDMEM培养基，根据细胞数量的多少确定小鼠的数量，加样备用。目前，一般情况24孔板1.5ml/孔，6孔板5ml/孔，大平皿30ml/板。 注意事项： 1，培养液和血清必须用新的，并记录批号。 2，制备过程严格无菌操作。 3，第二天确定没有污染后方可使用。,三，细胞的复苏 1、将新鲜培养基置于37 水槽中回温，回温后以75%酒精消毒，移 入无菌操作台内。 2、取50ml离心管，加入细胞冻存前所用基础培养液5ml。 3、根据复苏申请单，由细胞管理员将细胞从液氮中取出，细胞使用人核对后，立即放入37 水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1min内全部融化，以75%酒精消毒?，移入无菌操作台内。 4、取出复苏细胞悬浮液，缓缓加入已准备的培养液中，混合均匀后， 1500rpm离心5min。 5、将离心管取出，弃去上清，用含血清培养基重悬后,加入6孔板或小号平皿中，观察细胞复苏时状况并记录，37 5%CO2培养。 6、次日观察有无污染。,以下原因可能导致复苏失败： 1，饲养细胞有污染却没有发现。 2，细胞在水浴锅中时间过长或水进入冻存管。 3，操作过程存在污染。 4，没有更换枪头，导致交叉污染。 5，没有记录细胞的名称及其编号或者有重号现象。,四，细胞复苏的注意事项： 1，所用器材经过高压处理，培养基和血清是新的。 2，整个过程保证无菌操作。 3，复苏的关键是速融，一般在1min内。 4，及时更换枪头，避免交叉污染。 5，及时记录细胞的名称及其编号批号，切忌弄混。 6，复苏完毕后重新核实复苏的细胞名称和编号批号。 7，填写复苏记录表。,细胞复苏时机的选择： 平时一般选取在周五，原因：一般情况周五复苏后下周一会有一半细胞可以注射小鼠，一般三四天可以全部注射完，7天后的周一开始抽取，这样周末就不会太忙。假期前要合理规划复苏时间，不要留太多，一个制备周期大概就是20天左右。,第三章，细胞的培养和消化 一，细胞培养的概念及生长方式 二，细胞的常见污染及处理 三，细胞的消化 四，细胞培养的注意事项,一，细胞培养的概念： 把来自机体的组织经分散成为单个细胞，放在体外模拟体内的生理环境，在无菌、适当温度和一定的营养条件下，使之不断生长、繁殖或传代，借以观察细胞的生长、繁殖、衰老等生命现象。细胞培养的培养物可以是单个细胞（称为克隆培养），也可以是细胞群（称为群体培养）。见下图：,2019/10/4,概述,群体培养,克隆培养,细胞的生长方式： （1）贴附生长： 必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞。 （2）悬浮生长： 于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于 各种造血系统肿瘤细胞。,一次培养细胞的生长周期,2019/10/4,二，细胞培养的污染,细菌污染,小鼠胃癌细胞的球菌感染,培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，PH改变。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。,2019/10/4,二，细胞培养的污染,真菌污染,培养细胞受真菌污染后，可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，有的散在生长，培养液一般不发生混浊；倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。,丝状菌污染的污染,二，细胞培养的污染,支原体污染,培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染。,支原体污染检测,阳性,阴性,2019/10/4,二，细胞培养的污染,病毒污染,尽管病毒污染的细胞不影响原代培养，但生产疫苗是不安全的。因此，潜在病毒是细胞大量生产和疫苗、干扰素等生物制品制作中的难题。,冠状病毒扫描电镜图,2019/10/4,二，细胞污染的处理原则,细胞培养细胞一经污染，多数较难处理。如果污染细胞价值不大，宜弃之，并且用NaOH处理；在寻找原因后彻底消毒操作室，复苏或重新购置细胞，再培养。 小鼠腹腔回收法：小鼠腹腔是一个天然的过滤系统，将被污染的杂交瘤细胞注射进去后，腹腔会将污染物自动清除（包括支原体），等到长出腹水无菌操作回收细胞即可。,三，贴壁细胞的消化： 1，吸去培养液，用无菌的PBS、Hanks液或无血清培养液洗涤细胞一次，以去除残余的血清。 2，加入少量胰酶细胞消化液，略盖过细胞即可，室温放置30秒至2分钟。 3，显微镜下观察，细胞明显收缩，并且肉眼观察培养器皿底部发现细胞的形态发生明显的变化；或者用枪吹打细胞发现细胞刚好可以被吹打下来，此时吸除胰酶细胞消化液。加入含血清的培养液终止胰酶（竞争抑制），吹打下细胞，即可直接用于后续实验。 4，如果发现消化不足，则加入胰酶细胞消化液重新消化。 5，如果发现细胞消化时间过长，未及吹打细胞，细胞已经有部分直接从培养器皿底部脱落，直接用胰酶细胞培养液把细胞全部吹打下来，1000-2000r离心1min，尽量去除胰酶细胞消化液后，加入含血清的完全培养液重新悬浮细胞，即可用于后续实验。,三，贴壁细胞的消化： 1，吸去培养液，用无菌的PBS、Hanks液或无血清培养液洗涤细胞一次，以去除残余的血清。 2，加入少量胰酶细胞消化液，略盖过细胞即可，室温放置30秒至2分钟。 3，显微镜下观察，细胞明显收缩，并且肉眼观察培养器皿底部发现细胞的形态发生明显的变化；或者用枪吹打细胞发现细胞刚好可以被吹打下来，此时吸除胰酶细胞消化液。加入含血清的培养液终止胰酶（竞争抑制），吹打下细胞，即可直接用于后续实验。 4，如果发现消化不足，则加入胰酶细胞消化液重新消化。 5，如果发现细胞消化时间过长，未及吹打细胞，细胞已经有部分直接从培养器皿底部脱落，直接用胰酶细胞培养液把细胞全部吹打下来，1000-2000r离心1min，尽量去除胰酶细胞消化液后，加入含血清的完全培养液重新悬浮细胞，即可用于后续实验。,四，细胞培养时的注意事项： 1，要定期观察细胞的状态，发现问题及时处理，切忌将细胞弃之不顾。 2，不能频繁将细胞拿进拿出，会影响细胞的生长。 3，不能频繁更换培养基，细胞生长有一个适应过程。 4，必须更换培养基时应严格无菌操作，避免交叉污染。如液体变黄，死细胞过多等原因可考虑换液。 5，培养基应该做到专人专用。 6，发现细胞污染后需要及时处理，避免传染。,第四章，腹水的制备 一，细胞的准备 二，小鼠的选择 三，细胞的注射 四，腹水的抽取,一，细胞的准备： 细胞复苏后要密切关注其生长状态，一般要求注射数量为（5-10）105个/只，研发性细胞要求超过3/4孔注射两只。注射的细胞要求状态良好，处于对数期，细胞又圆又亮。 经验：一般情况下一批细胞复苏后两天就可以注射总数的一半，三天后注射剩下的一半，7天内基本可以全部注射。如果发现细胞聚堆现象要轻轻吹开，状态不好的细胞要换液并且加饲养细胞，但操作要轻柔。,吹打细胞时注意事项： 1，动作轻柔，不能溅到其他孔中 2，细胞时被吹掉的而不是被划掉的，不能留死角 3，及时更换枪头，避免交叉污染 4，及时在离心管上写上细胞信息。 生理盐水洗细胞时注意事项： 1，盖子要对号入座，避免交叉污染。 2，加生理盐水时应悬空，不能回溅到枪头上污染整瓶生理盐水,二，小鼠的选择 小鼠的选择很研发重要，不仅关系到腹水的数量还关系到质量，研发性和中样细胞必须挑选状态好的小鼠，小鼠健康标准：1,食欲旺盛；2,眼睛有神，反应敏捷；3,体毛光滑，肌肉丰满，活动有力；4,身无伤痕，尾不弯曲，天然孔腔无分泌物，无畸形；5,粪便黑色呈麦粒状；6,小鼠的尾、趾有无溃烂；7,检查眼、耳、鼻、肛门有无分泌物和异常增殖物;8,肚子不瘪进去,三，细胞的注射 一般情况研发性细胞每只注射0.4ml，中样和大样注射0.2ml。注射完毕后要及时把项目名称和编号及注射时间记录到笼子上面。 注意事项： 1，细胞数量和状态 2，细胞不能注射到皮下 3，笼子上细胞信息要完整 4，填写注射记录,四，腹水的抽取 注射完细胞一周左右时间 会长腹水，一般第六天就需要观察，防止胀死。小鼠腹腔明显胀大或者发黑就必须抽取，但首次抽取应该轻柔，不能抽取过度。个人操作对腹水产量有影响，因此尽可能熟练掌握，抽的又快又多。,抽取腹水时的注意事项: 1，抽取时机的把握，一周左右肚子明显胀大或者发黑。 2，抽取时应该轻柔，特别是第一次。 3，抽取部位不能太靠近大腿，否则伤口难以愈合。 4，研发性抽取时不要弄乱注射器，避免交叉污染，及时记录。 5，每次抽取前后吹打干净针头，防止堵塞。 6，发现针头变钝要及时更换。 7，倒腹水时看清楚，不能倒乱，不能倒进去沉淀。 8，抽取大样最好更换手套。,第五章，细胞的冻存 一，冻存原因 二，冻存要求 三，冻存失败原因 四，冻存时注意事项,一，冻存原因 因为在没有建立一个稳定的分泌抗体的细胞系的时候，培养过程中随时可能发生污染、分泌抗体的能力丧失等，假如没有原始细胞冻存，一切努力前功尽弃。 1，防止污染 2，避免染色体丢失 3，防止非分泌细胞的过度生长 4，防止细胞密度过高而死亡,细胞株分泌抗体的能力降低的原因： 由于细胞传代过多，可能造成某些细胞染色体的丢失，成为非分泌性的细胞，并且此种细胞有生长优势 ，造成分泌抗体能力降低，长此分泌性细胞会消失，建议发现后及时采取措施，可以多克隆几次，挑选阳性值高的再冻存使用。,二，细胞的冻存 冻存液:5