微生物检验技术及其应用医疗器械.ppt

微生物检验技术及其应用,上海市食品药品检验所 抗生素室、食品二室 徐伟东 博士 2011年11月29日,简 介,微生物鉴定分型技术在检验中的应用,微生物检验技术介绍,一,二,微生物主要来源 土壤：微生物的百花园 水：污染源 途径 空气：干燥 过路客 人和动物 加工环节,一、微生物检验技术介绍,食品安全的主要因素,关注欧洲104：4型肠出血性大肠杆菌疫情,西班牙阿尔梅里亚省和马拉加省的两家出口商受其感染后，患者会出现腹部绞痛和腹泻，尿毒症死亡 德国疾病控制机构疫情的源头精确至芽苗类蔬菜中的豆芽。由于发豆芽作坊卫生条件不佳，豆芽受污染，加上一些人喜好在蔬菜沙拉中拌入生豆芽，致使病菌直接进入人体消化道。食品安全和微生物专家同一天说，其实，错不在豆芽，而在人们不健康的饮食习惯。尽管一些蔬菜外表光鲜，实际却暗藏杀机。对多数蔬菜而言，煮食才健康。,公报说，德国104：4型大肠杆菌疫情暴发目前已可得到解释，其原因很可能是从埃及进口的胡芦巴种子被大肠杆菌污染，消费者食用德国企业用这些种子培育的芽苗菜后导致感染。此外还有人际接触造成的感染病例。 德国健康部门称，目前还不能排除其他种子由于产地不卫生的生产环境而被污染的可能性。同时中间商在清洗、混合和包装不同种子时也可能造成病菌污染其他种子。因此，健康部门要求消费者不要生食各种市场上供应的或自培的芽苗菜。消费者还被告诫应将尚存的芽苗菜种子清入垃圾箱。 目前，分管食品安全的联邦风险评估研究所还在评估芽苗菜之外其他由胡芦巴种子加工的产品中是否带菌，原因是胡芦巴种子还经常被用作佐料或入药。,新华网开罗7月6日电（记者李来房 冯康）埃及农业检疫部门6日发表声明，否认埃及出口的葫芦巴种子是欧洲肠出血性大肠杆菌疫情的源头。 埃及农业部网站当天刊登声明说，埃及当局对相关出口商库存的葫芦巴种子进行了抽样检测，所有结果均为肠出血性大肠杆菌阴性。 声明称，埃及2009年出口到欧洲的葫芦巴种子都通过了各国卫生检疫机构的检查，当时并未检测出这一污染，而且2009年11月出口的葫芦巴种子是干种子，这种细菌在干燥表面上不可能存活到今年6月。 声明认为，若怀疑葫芦巴种子遭到肠出血性大肠杆菌污染，这可能与再包装或用来泡芽的水等处理环节有关。 声明称，埃及国内没有肠出血性大肠杆菌病例的报告，埃及的种子是安全的，向欧洲出口蔬菜种子的绝大多数埃及出口商都非常重视整个供应链的卫生要求。 欧洲食品安全署5日发布报告称，在德国和法国暴发的肠出血性大肠杆菌疫情的源头很有可能是从埃及进口的葫芦巴种子。欧盟委员会负责卫生与消费者事务的委员约翰达利表示：“报告发布后我们便着手从市场上回收从埃及进口的种子并暂时禁止从埃及进口相关品种。” 根据德国主管传染病防控的罗伯特科赫研究所5日公布的疫情通报，德国自两个月前暴发肠出血性大肠杆菌疫情至今，已累计出现4086例感染病例，共有48人死亡。本月2日法国也宣布出现首例感染肠出血性大肠杆菌死亡病例。,一、微生物检验技术介绍,检测技术的重要性,按照标准进行 传统的生化反应鉴定,API试剂条 菌鉴定国际金标准,半自动细菌鉴定仪 （ATB Expression）,微生物鉴定,Mini VIDAS筛选系统,免疫凝集/免疫沉淀实验,微生物检测,实时荧光定量PCR,色谱、光谱分析技术,分子生物学技术,一、微生物检验技术介绍,传统筛选系统,一、微生物技术介绍,微生物的检测技术,显色培养基,显色培养基检测基本原理：利用不同种属细菌代谢所产生的酶的特异性，在培养基中加入相应的特异性酶底物和抑制剂，当具有某特异酶的细菌与酶底物作用时，使显色基团游离出来附着于菌落上，形成颜色独特的菌落。根据菌落的颜色直接对菌属（种）作出鉴定。,GB4789-2008、2010中 新技术的应用-显色培养基,沙门氏菌 志贺菌 副溶血性弧菌 O157：H7大肠埃希菌 单增李斯特菌 阪崎肠杆菌 大肠杆菌计数,显色培养基的优势,快速、简便、节省时间-大多数显色培养基只需在样品增菌后，分离培养1824h，即可根据菌落的颜色作出初步的鉴定。（阴性-弃去；阳性-进一步鉴定）。 结果直观，一目了然（根据颜色判定结果）。 灵敏度高、特异性强，大大减少了后续的鉴定步骤（确证试验）。,显色培养的缺陷,假阳性： 97%的大肠埃希菌含有-葡萄糖苷酶，约10%的沙门氏菌属中也含有此酶。 假阴性： O157：H7大肠埃希菌没有-葡萄糖苷酶，在MUG-LST上呈阴性反应。 不是所有具有特征性酶的微生物均在含底物的培养基中呈阳性反应。 提示：这是任何选择性培养基都无法避免的问题。与普通选择性培养基比较，显色培养基的假阳性、假阴性的机率相对要低得多。,乳胶凝集反应,原理： 乳胶凝剂试验是以乳胶微粒为载体的间接凝集试验。 用人工方法将抗体包被于与免疫无关的大分子聚苯乙烯或羧化聚苯乙烯乳胶颗粒上。 利用抗原抗体特异性结合的特性，当敏感的乳胶颗粒与待检细菌菌悬液混合后，迅速形成肉眼可见的凝集团块，用于筛选可疑菌。,乳胶凝集试验的优势,特异、敏感； 操作简便、快速； 结果易判读； 阴性预测值高。,常用Microgen乳胶凝集试验盒,李斯特菌（listeria） 沙门氏菌（salmonella） 弯曲杆菌（camylobacter） 大肠杆菌O157（E.coli O157） 军团菌（legionella） 葡萄球菌（staph）,观察凝集结果,全自动荧光免疫分析仪(VIDAS-mini或30),检测项目：食品及环境中常见致病性细菌（李斯特菌属、单核增生李斯特菌、弯曲菌属、大肠埃希菌O157、沙门氏菌属、葡萄球菌肠毒素检测）的快速筛检,全自动荧光免疫分析仪(VIDAS),原理： 以免疫技术捕获目标微生物，应用酶联免疫法，最后测蓝色荧光（ELFA）。包被针上有抗体包被，所测得的荧光与标本中抗原的含量成正比。 特点： 结果准确：对每个标本做两次免疫反应，保证结果的可靠。灵敏度比可见光方法高出1000倍。已获得美国FDA、日本厚生省、AOAC、USDA、中国进出口商品检验局等政府及权威机构认可。 可同时进行12个相同或不同的测试。每天进行约6080项测试 特异性强：标本不需分离出目标微生物即可上机检测。 避免交叉污染：没有采样针，避免标本之间交叉污染；样品不与仪器接触，仪器内没有抽吸样品的管路，杜绝了标本对环境的污染,荧光定量PCR,聚合酶链式反应技术（PCR）是分子生物学技术最具有代表性的技术。它是一种能在体外将微量生物DNA分子进行数百万倍放大的新型检测技术。 荧光定量PCR技术在普通PCR技术基础上，通过荧光染料的结合，将检测信号进一步放大，其灵敏度是普通PCR的几百倍，扩增和检测过程由仪器自动完成，检测同量高，速度快 除去样品前增菌时间，2-4小时内可得到检测结果,微生物检测限可能达到1 copy，抗杂菌干扰能力强,免疫磁珠技术,由于受到抽样数量、检验方法和试验取样量的限制，无法将全部样品进行检查。磁珠分离技术，能简单快速地捕捉特异的蛋白、遗传物质和其他生物分子。通过免疫磁珠富集手段，将微量的目标物质通过磁珠富集到可检测的水平。 这一技术不仅可应用于致病微生物的检测，还可用于食品中致敏原蛋白质、核酸以及各类细菌毒素的富集，应用范围广阔，适宜高通量、全自动操作。,Principle: Immunomagnetic Microparticle Separation/Concentration of Bacterial Cells,BioLumixTM微生物实时快速检测系统是最新推出的用于食品、保健品、乳制品、肉制品、饮料、化妆品、洗化产品和制药等工业领域和监管部门等使用的微生物快速检测系统。可以快速确定样本中细菌总数、大肠菌群/大肠杆菌、致病菌、霉菌等的存在与数量。,BioLumixTM实时快检系统-简便、快速并可降低微生物试验的操作成本。,-装有增菌培养基和指示剂的检测管。 -数小时内得到检测结果（而非数天） -结果易解释并自动传输到需要快速发运安全产品的地方。 -非微生物专业技术人员也能够操作。,可检测的项目:,大肠菌群 大肠杆菌 肠杆菌科 革兰氏阴性菌 乳酸菌 酵母菌和霉菌 假单胞菌 蜡样芽胞杆菌 葡萄球菌 沙门氏菌,卫生监控 保质期预测 腐败菌检测 无菌检验 挑战实验 微生物限定检测 嗜热菌计数 嗜冷菌计数 抗生素残留检测,生物体可以在BioLumix仪器中进行孵育，孵育温度可以在15C到60C的范围内预先设定，以使各种菌株都能获得最佳的生长条件。,检测原理,BioLumixTM专利的完整检测的基础是：使用新开发的染色技术检测生物体的代谢过程。这一技术通过将染色、新的光源和光传感器相结合，能够用同一个检测器同步检测颜色和荧光的变化。当代谢过程发生时，试剂的光谱模式会发生改变。光传感器可检测到这些改变，并以预先设定的时间间隔进行监控。,BioLumixTM的灵敏度和检测范围,灵敏度为每个样本管内一个细菌或真菌的活细胞。 一个细菌通常可在8-14个小时内检出 一个酵母菌可在20-24个小时内检出；菌数越多，检测时间越短 尽管系统可以检出少至每管一个细胞，但是生物体必须首先要增长到超过预先确定的明确的检测阈值。 -细菌的检测阈值为每毫升100,000个细胞（105/ml）； -酵母菌/霉菌的检测阈值为每毫升10,000的细胞（104/ml）,检测时间取决于样品中微生物的初始浓度。污染程度越高的样本检测得越快，并可迅速发出污染警告。 如果样品中细菌总数初始浓度为每毫升100,000个细胞 （105/ml）， 则检测仅需4个小时左右！,一、微生物技术介绍,细菌分型的定义,不同种属细菌间的差异 细菌分型是指通过一定的实验方法对属于同一种或亚种的细菌分离株进行遗传特征分析，并结合分离株的流行病学资料，阐明被分析株间的遗产关系,传统的微生物鉴别,微生物的鉴定及其分型技术,现代的 微生物 鉴别,血清学鉴定,原理： 细菌的抗原与抗体在一定条件下可产生凝集反应，形成肉眼可见的颗粒或沉淀。 多用于细菌菌属或属内种的鉴定。 培养基：一般使用1.5%的琼脂斜面作纯培养，取培养基（抗原）作玻片凝集试验。,GB4789中的血清学鉴定,沙门菌（A-F多价血清）； 志贺菌（志贺菌多价血清）； 致泻性大肠埃希菌（EPEC、EIEC 、 ETEC多价血清） 大肠埃希菌O157：H7/NM（O157、H7血清） 副溶血性弧菌（O、K血清）； 小肠结肠炎耶尔森菌。,生化鉴定API试剂条菌鉴定国际金标准,无需专用仪器，标准化手工方法完成细菌的生化鉴定，为低成本替代传统手工细菌生化鉴定的最佳产品。 特点： 完整的鉴定谱：15种试条，可鉴定的细菌多于550种 简单方便：标准化方法，成本低廉，判读结果简单 快速结果：4-24小时。,生化鉴定半自动细菌鉴定仪（ATB Expression）,检测项目：可鉴定由环境、原料及制成品分离出的菌种和药敏试验（包括：肠杆菌、非发酵G（-）杆菌、葡萄球菌、链球菌、酵母菌、厌氧菌）。可鉴定770种细菌和分析近80种抗生素药敏实验。,原理：鉴定试条包含风干底物的反应孔，经标准浊度的菌液活化，于指定温度培养4小时/24小时后即可。计算机根据阅读器检测到的结果自动调用相应试剂条数据库，得出生化/同化结果和药敏试验结果。系统将所得编码跟数据库的典型菌株生化谱比较，以客观的2个参数（鉴定百分率及T-值）计算鉴定结果 特点： 速度快捷ATB Expression提供自动化接种，阅读及分析试条结果。 准确可靠的结果ID 32及快速ID 32 试条由金牌标准API试条改良而成，配合自动化概念，结合成完整的细菌鉴定系统,生化鉴定半自动细菌鉴定仪（ATB Expression）,生化鉴定全自动细菌鉴定仪（VITEK 2）,检测项目：根据需要鉴定的微生物的种类的不同，设计了不同的鉴定卡片，比如革兰氏阴性菌卡，革兰氏阳性菌卡，酵母菌卡等。可鉴定405种细菌，70多种药物约50多种药物组合的药敏卡。,生化鉴定全自动细菌鉴定仪（VITEK 2）,原理：仪器的原理其实就是我们进行细菌鉴定中使用的生化反应。仪器把30个对细菌鉴定必需的生化反应培养基固定到卡片上，然后通过培养后仪器对显色反应进行判断，利用数值法进行判定。 特点： 快速：鉴定结果平均只需4-6小时。对与快速生长细菌(大肠埃希氏、粪肠球菌、变形杆菌、克雷伯氏菌等)鉴定可提前到2小时。 操作简便：全部操作自动化，简单而方便 资料处理：bioLIAISON软件集中管理实验室资料 获得AOAC 国际认证：保证提供的微生物鉴定结果是公认的,物质成分分析,基于蛋白质、多糖的分子分型技术,近红外傅立叶光谱分析,FT-IR技术以未损伤细胞的FT-IR光谱的特殊指纹区为基础，光谱反映的是整个细胞组成分子的振动特征，也就是蛋白质、核酸等物质的特征 由于这些细胞组分与基因表达有关，反应了全细胞组分的综合信息所得图谱有效地反映了细胞表型和基因型信息，从而区分生化信息上的差别,德国Bruker公司微生物FT-IR分析用户手册主要采用1200-900cm-1，3000-2800cm-1，1500-1400cm-1谱段组合进行微生物判别分析，这3个谱段分别主要代表了微生物细胞壁多聚糖、细胞膜脂肪酸以及细胞质膜蛋白质和类脂成分的信息。,色谱分析,微生物中含有的一些称为生物标志物的化学物质，其含量或结构具有种属特征或与其分类位置密切相关 通过分析微生物的化学组成鉴定微生物，开辟了一个微生物检测和鉴定的新途径 高效液相色谱(High - performance liquid chromatography，HPLC) 气相色谱(Gas chromatography，GC) 气相色谱质谱联用(Gas chromatography - mass spectrometry，GC-MS) 液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS),建立各种生物标志物在微生物中分布情况的数据库及相应的标准分析程序，仍然是色谱分析微生物的主要方向,基于蛋白质反而分型方法 MALDI-TOF MS,原理是离子在电场作用下加速通过飞行管道，记录离子到达检测器的飞行时间 测定离子化生物分子的质荷比 可以得到相关分子的质量,飞行时间质量分析器,MALDI-TOF MS 工作流程,基于DNA的分子分型技术,DNA测序技术,DNA测序技术可以将生物的遗传信息完整的破译出来，通过直接比较不同类群个体同源核酸的核苷酸排列顺序，获得生物进化、变异的详细信息 如细菌的16S r DNA和真菌的ITS序列，已经被广泛测定应用于菌种鉴定研究之中 国际通用数据库NCBI-GenBank,16S rDNA分型,葡萄球菌之间16S rDNA同源性分型,已有扩增16S rDNA基因序列的通用引物 可直接用于实验室间比对 数据获得容易 可同时进行鉴定和分型 菌种鉴定水平高 分型能力较差,指纹图谱技术,分子杂交技术首先用限制性内切酶对细菌基因组DNA进行酶消化，通过特异性探针与目标DNA序列的杂交结合，经过转膜技术和显色技术形成该细菌特有的杂交图谱。 现有成熟的基于核糖体的分子杂技图谱库涵盖了200个属的1200多种6950株微生物，为各研究和实验机构提供了一个统一的微生物分型标准。,核糖体分型（RiboPrinter）,葡萄球菌RiboPrinter分型分析,全自动系统操作简单 结果重现性好 鉴定分型结果一次给出 依赖数据库 仪器试剂昂贵 分型能力一般,脉冲场电泳技术（PFGE）,PFGE 目前被公认为沙门菌的标准分型方法 中国、欧洲和美国已把该方法作为食源性病原菌的标准分型方法 美国CDC具有庞大的病原菌数据库 追踪传染源 处理应急 流行病学分析 发展控制和教育活动,脉冲场电泳技术（PFGE）,鸡肉中分离的450株沙门菌PFGE分型,脉冲场电泳技术（PFGE）,良好的重复性 可用于实验室间结果比对 通常用于对已有准确生化鉴定结果的细菌分型 操作繁琐，通量小 相关的分析处理软件昂贵 分辨力高：同一PFGE型不一定是同一株菌,多位点序列分析 (MLST),通过直接测定多个管家基因的核苷酸序列发现细菌变异的分型方法 一般测定6-10个管家基因片段，每个位点的序列根据其发现的时间顺序给予一个等位基因编号，每个菌株的等位基因编号按指定顺序排列就是等位基因谱，即ST（ sequence type）,管家基因,管家基因又称持家基因（house-keeping genes），是指所有细胞中均要表达的一类基因，其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的。如微管蛋白基因、糖酵解酶系基因与核糖体蛋白基因等。具有相同遗传信息的同一个体细胞间其所利用的基因并不相同，管家基因活动是维持细胞基本代谢所必须的，这正是细胞分化、生物发育的基础。,多位点序列分析 (MLST),染色体不同保守位点之间的序列分析 具有国际统一的序列和分析方法 分型能力强 仅针对有研究的数个细菌种属,多位点重复序列分析 (MLVA),基于染色体上的重复序列 需要基因组数据 通过PCR方法扩增重复序列，确定重复序列的重复次数,重复序列,MLVA技术,MLVA技术优缺点,优点 PCR方法 分辨力强 成本低 缺点 需要基因组测序数据 数据库有限 只能对同一种属细菌进行分析,简 介,微生物鉴定分型技术在检验中的应用,微生物检验技术介绍,一,二,二、微生物检验技术在检验中的应用,实验室洁净环境监控，构建环境微生物分布图，提高检测结果公信力,无菌检查法是对药品微生物控制质量中的最严格要求 但对污染的来源问题上，无菌检查法本身具有无法弥补的缺陷 对检测机构而言，自身检测环境的控制要比样品检测更加重要 只有排除检测过程中的微生物污染，才能有足够的理由相信，样品污染来自药品本身,2008年“刺五加事件”及2009年“双黄连注射液”事件中相关产品微生物污染的确定经过有关单位多次反复试验才得以确认,2.1洁净环境微生物监控,头状葡萄球菌（Staphylococcus capitis） 溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus） 缓症链球菌（Streptococcus mitis） 科氏葡萄球菌（Staphylococcus cohnii） 藤黄微球菌（Micrococcus luteus） 同一株菌反复污染洁净环境要引起检验人员高度重视 仅靠洁净室内部消毒措施很可能起不到排除污染的作用 要对洁净室送风系统和检验人员携带污染进行全面调查 建立环境微生物污染趋势分析图，预测微生物污染方向，从被动的排查污染措施上升到主动的预防、预警。将污染信息并与历史污染物比对，回顾调查，帮助质量体系的改进。,常见洁净环境微生物污染,中国现行药品生产企业执行的GMP中微生物监控部分仅要求企业对洁净生产区的浮游菌、沉降菌和表面微生物的数量进行控制。只要企业在发现污染后对整个生产区域进行消毒，达到微生物数量控制标准即可,潜在危险是很难查清污染的真正来源，容易造成同一地点、同一类型的反复污染，对产品安全是一个极大的隐患。,2006年发生的“齐二药亮菌甲素”事件和“欣弗事件”暴露了我国监管部门在GMP体系监管中的漏洞,美国FDA在要求药厂将微生物鉴定到“种”一级，并建议在微生物形态和生化反应鉴定之外采用基因分型技术进行分析，以便对生产环境的微生物污染进行监控,2.1洁净环境微生物监控,微生物实验室应首先确保实验室的设施和环境不会对检验过程带来微生物污染，杜绝实验结果假阳性和假阴性的发生 通过直接比较不同类群个体同源核酸的核苷酸排列顺序，获得生物进化、变异的详细信息 在日常环境监控过程中收集、鉴定环境微生物建立环境监控数据库，与样品中分离得到的微生物做比较，分析微生物污染来源，出具客观的检测报告。,2.1洁净环境微生物监控,2.1.1 实验室洁净环境微生物监控,建立实验室洁净区采样方案 医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法（GB/T 16292162941996） 药品生产质量管理规范（2010修订版） 以一个月为周期，连续监测实验室环境 不定期对本所无菌室洁净环境进行抽样调查，积累洁净环境微生物种群和分布数据,检查内容包括沉降菌检测、浮游菌检测、表面微生物检测和操作人员卫生检测等,建立和健全日常监督检查方法,生产过程中覆盖从原材料到终产品的全过程监控,对空气采样共设置16个采样点 ，同时增设表面微生物采样点 表面细菌的测定采用平板接触法，包括房间的门把手、操作人员操作服胸口和前臂处、手套、口罩、拖鞋底等 微生物随着操作人员更容易进洁净环境，最可能成为污染的主要来源,微生物污染涉及药品生产、流通和消费三大领域,生化鉴定方法与分子生物学鉴定方法的结果匹配率比较,同时采用多种鉴定手段，能促进方法学的改进，统一检验标准，保证结果的重复性、一致性、可信性和国际认可性，为政府执法、仲裁提供科学的依据,生化反应系统在“属”一级的鉴定结果与分子生物学方法一致性较高 生化鉴定的结果无法进一步细分到“种” 由于对生化反应终点的判定和操作影响等原因，同为生化反应原理的API系统与VITEK系统鉴定结果也不一致,微生物种属鉴定方法,2.1.1 实验室洁净环境微生物监控,在实验环境中以葡萄球菌属（Staphylococcus）分离数目最多为34% 微球菌属（Micrococcus）和芽孢杆菌属（Bacillus）次之，分别为19.15%和17.04% 假单胞菌属（Micrococcus）、莫拉菌群（Moraxella）、短波单胞菌属（Brevundimonas）占4.26% 短杆菌属（Brevibacterium）、不动杆菌属（Acinetobacter）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、泛菌属（Pantoea）等所占比例归于其他项中 收集的环境微生物中酵母菌占8.51%，主要为近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis）和粘红酵母（Rhodotorula mucilaginosa） 霉菌等丝状真菌占4.26%，主要为青霉菌属,2.1.1 实验室洁净环境微生物监控,2.1.2 环境微生物菌株信息库的建立,我们连续三个月对实验室洁净环境中部分环境微生物进行追踪，并进行同源性分析,以葡萄球菌属为例，本实验室共收集到16株葡萄球球菌属细菌。 7、8月分别收集到的细菌239与250和232与246之间同源性较高，归在一个子类中，属于同源污染。 说明7月和8月之间的消毒灭菌过程不彻底，存在消毒漏洞。 经过消毒，在9月份监测过程中收集到的葡萄球菌中未发现有和前两月同源的菌株，说明前期的污染已经消除，9月份收集到的部分葡萄球菌为新进入环境的微生物。,2.1.2 环境微生物菌株信息库的建立,二、微生物检验技术在检验中的应用,本所抗生素室对某药业上海制药工厂生产车间进行了沉降菌检查，在洗瓶间和生产车间布置了15个监测点。将TSA平板静态暴露于车间环境4h后，在33下培养48小时，经平板计数共收集沉降菌106株。 通过形态学和革兰氏染色结果将所得菌株初步分为37类，经过菌株鉴定，共得到16个属22个种的微生物分布图。 虽然，在本次浮游菌检测任务中在15个采样点内未监测到大肠杆菌菌株，说明在监测时生产车间产品受到大肠杆菌污染威胁不大。 但是，由于监控的空间跨度和时间跨度有限，不能排除该企业潜在的大肠杆菌污染危害。,2.3.1上海某药业产品受微生物潜在污染风险,经分析，发现如下问题，提请该药品生产企业注意 在高洁净度等级的层流罩和生产车间内采集到沉降细菌和霉菌菌落，企业产品的质量安全存在潜在的安全隐患。建议企业采取灭菌消毒等有效措施，全面清洁生产环境，加强对梅雨季节容易产生的霉菌污染的控制 配间11采样点的微球菌和洗瓶间2采样点检测到的微球菌属于同源菌株，配间采样点9和洗瓶间8检测到的葡萄球菌也为同源菌株，显示配间和洗瓶间存在交叉污染情况 在全部采样点中葡萄球菌和微球菌均为人体易携带污染的微生物种类，且这两类微生物在多个采样点均有发现，提示该车间操作人员在操作和移动过程中的污染较为严重 在该检测环境中发现了较难消毒灭菌的芽孢杆菌属细菌，企业在常规消毒过程中要注意加强消毒剂剂量和延长消毒时间,2.3.1上海某药业产品受微生物潜在污染风险,某制药厂沉降菌同源性分析,检测实验室 微生物信息库,企业 微生物信息库,同 源 性 分 析 比 对,污染源,是,否,2009年国家药品抽验任务无菌检验过程中发现有一个厂家2个批次（抽200911162和抽200910927）的药品无菌检测不合格，无菌集菌器中培养基变浑浊，有未知丝状真菌生长，按照国家标准应判定该产品不合格。 为保证检验结果的可靠性，在分子生物学技术平台的基础上鉴定，这两株微生物与青霉菌（Penicillium sp.）相似度较高 样品抽200911162和抽200910927在系统发育树中处于同一个分支，亲缘关系较为相近，属于同源污染物 相反的，样品ITS序列与本实验室的历史环境菌株ITS序列差异较大，亲缘关系远，属于非同源菌株,可以证实，样品中青霉菌的污染源自于生产厂家的生产加工过程，与检验环境和检验过程无关。最终给出该厂两批次产品不合格的鉴定结论，鉴定周期仅为7天,2.2.1 在真菌污染检查中的应用,真菌的鉴定流程图,菌株414-Asperallus sp.做为已知的外群微生物，407-Penicillium sp.和413-Penicillium sp.为实验室历史监测中收集的青霉菌株,基于真菌ITS序列构建的系统发育树（NJ法）,2.2.2 在细菌污染检查中的应用,在国家药品抽验任务中，常规检验方法检出三批无菌样品（抽200911213-1，抽200911213-2和200911214）的培养基出现浑浊，被判为不合格。 以样品抽200911214为例，根据菌落形态、生化反应API和分子生物学的鉴定结果可知此菌可能为放线菌。 但是，生化鉴定仪器VITEK的鉴定范围不包含放线菌科。 由于微生物在不同生长时期，不同生长条件下的形态特征及代谢情况有所不同，采用生化反应为鉴别基础的技术时常失效，而分子生物学鉴定时建立在生物遗传信息基础之上，结果更为稳定可靠