细菌学检验

2019/10/18,1,第三章 临床细菌学检验,周天戟,2019/10/18,2,本章内容,第一节 标本的采集和处理原则 第二节 细菌的形态学检查 第三节 细菌的分离培养和鉴定 第四节 细菌的非培养检测方法,2019/10/18,3,第一节 标本的采集与处理,一、标本采集的一般原则 1早期采集 2无菌采集 3根据目的菌的特性用不同的方法采集 4采集适量标本 5安全采集,2019/10/18,4,二、标本的处理,1. 对环境敏感的细菌如脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌和流感嗜血杆菌等应保温并立即送检 2. 其他所有的标本采集后最好在2h之内送到实验室 3. 若不能及时送检，标本应置于一定环境中保存 4. 一般情况下，用于细菌培养的标本保存时间不应超过24h 5. 标本切勿污染容器的瓶口和外壁，容器必须包装好，防止送检过程中倒翻或碰破流出 6. 烈性传染病标本运送时更要特别严格，必须按规定包装，由专人运送 7. 厌氧性标本应放在专门的运送瓶或试管内运送，可直接用抽取标本的注射器运送,2019/10/18,5,药物敏感试验,直接涂片镜检,分离培养,形态学试验 生化试验 免疫学试验 动物试验,明确诊断,初步诊断,免疫学试验 分子生物学技术 其他检测技术,细菌感染的检验程序,辅助诊断,2019/10/18,6,第二节 细菌的形态学检查,1.镜检可以了解有无细菌及大致的菌量 2.通过形态学检查可得到初步诊断，对临床早期诊断和治疗疾病有一定的参考意义 3.根据细菌形态、结构和染色性有助于对病原菌的初步识别和分类，用于细菌鉴定,细菌形态学检查的意义,2019/10/18,7,不染色标本的检查：初步观察、细菌动力 单染色法：细菌形态 复染色法：细菌形态、结构与鉴别 革兰染色法（Gram stain） 抗酸染色法（acid-fast stain） 特殊染色法：负染色、鞭毛染色,细菌的形态学检查法,2019/10/18,8,一、不染色标本,1.细菌不经染色直接镜检，主要用于检查生活状态下细菌的动力及运动状况 2.常用的方法有压滴法和悬滴法 有动力：可看到细菌自一处移至另一处，有明显 的方向性位移 无动力：细菌呈现布朗运动，只在原地颤动而无 位置的改变 3.有些病原菌通过不染色标本的动力检查可作出初步鉴定 如疑似霍乱患者，镜下观察到来回穿梭似流星状运动的细菌，制动试验阳性，可初步推断为“疑似O1群霍乱弧菌”。,2019/10/18,9,二、染色标本,（一）常用染料 1碱性染料：碱性复红、结晶紫、美蓝等 2酸性染料：有伊红、刚果红等 3复合染料（中性染料）及荧光染料：复合染料有瑞氏染料（伊红美蓝）、姬姆萨染料（伊红天青）等；荧光染料有荧光标记的抗体,2019/10/18,10,（二）常用的染色方法,革兰染色（gram stain） 方法： 1、结晶紫初染 1 min 2、卢戈氏碘液媒染 1 min 3、95酒精脱色 30sec1 min 4、稀释石炭酸复红复染 1 min 原理： G+等电点低，带正电荷的碱性燃料作色牢固 G+细胞壁肽聚糖层多，G-细胞壁脂质含量高 G+含有多量核糖核酸镁盐与结晶紫、碘结合成大分子复合物 意义： 鉴定细菌 与致病性有关 参考选择抗菌药物 用途：一般细菌学检查或鉴定,革兰阴性杆菌,革兰阳性球菌,2019/10/18,11,（二）常用的染色方法,抗酸染色（acid-fast stain） 方法： 1、石炭酸复红初染加热35min，水洗 2、3% 5%盐酸酒精脱色30s，水洗 3、碱性美蓝复染30s，水洗。 原理：分枝杆菌属的细菌，胞壁脂质多，其中的分枝菌酸与石炭酸复红结合成牢固的复合物，能抵抗脱色 意义：可将细菌分为两大类： -抗酸性细菌 -非抗酸性细菌 用途：分枝杆菌属的直接检查与鉴定,2019/10/18,12,（二）常用的染色方法,荧光染色 （1）荧光染色法敏感性强，效率高而且容易观察结果，在临床细菌鉴定中有很大的实用价值。 （2）主要用于结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、白喉棒状杆菌及痢疾志贺菌等的检测。 鞭毛染色：可观察到菌体上有无鞭毛、鞭毛的位置及数量，在细菌鉴定中，特别是非发酵菌的鉴定中很重要。 异染颗粒染色：用于白喉棒状杆菌的鉴定。,2019/10/18,13,（二）常用的染色方法,芽胞染色：用于细菌的鉴定。,墨汁染色: 一般用于新型隐球菌的检查,2019/10/18,14,第三节 细菌的分离培养和鉴定,接种培养基,选择培养方法,选择可疑菌落,选择鉴定方法,采集标本,分离培养和鉴定是细菌学检查的标准方法，优先用于绝大多数细菌感染的诊断,2019/10/18,15,细菌的分离培养和鉴定,一、培养基的种类和选择 培养基的组成成分、培养基种类、培养基的选择 二、分离及培养 细菌的接种、细菌培养方法 三、细菌的鉴定-生化反应和其他方法 碳水化合物的代谢试验 蛋白质和氨基酸的代谢试验 碳源和氮源利用试验,2019/10/18,16,一、培养基的种类和选择,培养基（culture medium） 是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养物制品。,2019/10/18,17,(一)培养基的组成成分,1营养物质 蛋白胨、肉浸液、牛肉膏、糖类、醇类、血液、 无机盐类、鸡蛋和动物血清生长因子 2凝固物质 琼脂、明胶、卵白 3抑制剂和指示剂 胆盐、蔷薇酸等，酚红、中性红、溴甲酚紫等,2019/10/18,18,（二）培养基种类,1基础培养基（based medium） 2营养培养基（nutrient medium） 3鉴别培养基（differential medium） 4选择培养基（selective medium） 5特殊培养基（special medium）,2019/10/18,19,1基础培养基（based medium）,含有大所属细菌生长所需的基本营养成分，最常用的是肉浸液，俗称肉汤（broth），主要成分含牛肉浸液和蛋白胨。用于培养一般细菌,2019/10/18,20,2营养培养基（nutrient medium）,用于培养营养要求较高的病原性细菌，最常用的如血琼脂平板、巧克力血平板等，,2019/10/18,21,3鉴别培养基 （differential medium）,在培养基中加入特定底物和指示剂，观察细菌不同的代谢产物，以鉴别细菌。如糖发酵管、克氏双糖铁琼脂（KIA）、伊红-美蓝琼脂和动力-吲哚-尿素（MIU）培养基等。,2019/10/18,22,4选择培养基（selective medium）,在培养基中加入抑制剂抑制杂菌，以利目的细菌生长，如SS琼脂使致病的沙门菌、志贺菌容易分离到,2019/10/18,23,5特殊培养基（special medium）,疱肉培养基用于培养厌氧菌 巯基乙醇酸纳培养基用于培养细菌L型,2019/10/18,24,培养基种类-按物理性质,液体培养基：用于增菌培养、生化反应等 固体培养基: 平板: 分离培养 斜面: 菌种短期保存、生化反应等 半固体培养基: 动力试验、菌种长期保存等,2019/10/18,25,（三）培养基的选择,目的病原菌：伊红美蓝/麦康凯用于筛选革兰阴性杆菌，血平板用于分离病原性球菌。,标本来源：从血液、骨髓中分离病原菌先用血液肉汤增菌，粪便标本分离培养肠道病原菌用SS琼脂，,2019/10/18,26,二、分离及培养,1平板划线分离法 2斜面接种法 3液体接种法,（一）细菌的接种,4穿刺接种法 5倾注平板法 6涂布接种法,2019/10/18,27,（二）细菌培养方法,1需氧培养法：普通温箱 2二氧化碳培养法 ：烛缸法、二氧化碳培养箱 3厌氧培养法：厌氧袋（罐）法、厌氧培养箱、疱肉培养基法,2019/10/18,28,沉淀生长,混浊生长,表面生长,液体培养基中,2019/10/18,29,固体培养基中,菌落（S型）,菌苔,菌落（R型）,细菌的生长情况观察,2019/10/18,30,混浊生长,沿穿刺线生长生长,有鞭毛 细菌,无鞭毛 细菌,半固体体培养基中,2019/10/18,31,三、细菌的鉴定,（一）碳水化合物的代谢试验 1. 糖（醇、苷）类发酵试验 是鉴定细菌最主要和最基本的试验，特别对肠杆菌科细菌的鉴定尤为重要,生化反应,2019/10/18,32,2氧化发酵试验（O/F试验）,主要用于肠杆菌科细菌与非发酵菌的鉴别，前者均为发酵型，而后者通常为氧化型或产碱型。也可用于葡萄球菌与微球菌间的鉴别。,2019/10/18,33,3半乳糖苷酶试验（ONPG试验）,迅速及迟缓分解乳糖的细菌ONPG试验为阳性，而不发酵乳糖的细菌为阴性。本试验主要用于迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定。,2019/10/18,34,生化反应,4七叶苷水解试验 主要用于D群链球菌与其他链球菌的鉴别。 5甲基红试验 主要用于鉴别大肠埃希菌与产气肠杆菌。 6VP试验 本试验常与甲基红试验一起使用，因为前者阳性的 细菌，后者通常为阴性。,2019/10/18,35,（二）蛋白质和氨基酸的代谢试验,吲哚(靛基质)试验：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。,明胶液化试验：主要用于肠杆菌科细菌的鉴别。,硫化氢试验 培养基：PbAc或FeSO4 培养基 应用：主要用于肠杆菌科中属及种鉴别,2019/10/18,36,生化反应,4尿素分解试验 主要用于肠杆菌科中变形杆菌属细菌的鉴定。 5苯丙氨酸脱氨酶试验 主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。变形杆菌属、普罗菲登斯菌属和摩根菌属细菌均为阳性，肠杆菌科中其他细菌均为阴性。 6氨基酸脱羧酶试验 主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。,2019/10/18,37,（三）碳源和氮源利用试验,1枸橼酸盐利用试验 用于肠杆菌科中菌属间的鉴定。 2丙二酸盐利用试验 肠杆菌科中属间及种的鉴别。,2019/10/18,38,（四）各种酶类试验,1氧化酶试验主要用于肠杆菌科细菌与假单胞菌的鉴别。 2过氧化氢酶试验（触酶试验）用于革兰阳性球菌的初步分群。,2019/10/18,39,3硝酸盐还原试验,本试验在细菌鉴定中广泛应用。肠杆菌科细菌均能还原硝酸盐为亚硝酸盐；铜绿假单胞菌、嗜麦芽假单胞菌等假单胞菌可产生氮气；有些厌氧菌如韦荣球菌等试验也为阳性。,2019/10/18,40,三、生化反应和鉴定,4脂酶试验 主要用于厌氧菌的鉴别。 5卵磷脂酶试验 主要用于厌氧菌的鉴定。 6 DNA酶试验 在革兰阳性球菌中只有金黄色葡萄球菌产生DNA酶，在肠杆菌科中沙雷氏菌和变形杆菌产生此酶。,2019/10/18,41,三、生化反应和鉴定,8 CAMP试验 在链球菌中，只有B群链球菌CAMP试验阳性，故可作为特异性鉴定。,7 凝固酶试验作为鉴定葡萄球菌致病性的重要指标，也是葡萄球菌鉴别时常用的一个试验。,2019/10/18,42,（五）抑菌试验,原理：利用细菌天然耐药性 1 O/129抑菌试验 用于弧菌科的属间鉴别，弧菌属、邻单胞菌属对O/129敏感，而气单胞菌属耐药。 2杆菌肽试验用于A群链球菌与非A群链球群的鉴别。 3奥普托欣（Optochin）试验主要用于肺炎链球菌与其他链球菌的鉴别。,2019/10/18,43,第四节 细菌的非培养检测方法,一、免疫学检测 抗原检测、抗体检测 二、分子生物学检测 核酸杂交、聚合酶链反应、生物芯片技术 三、细菌毒素的检测 内毒素、外毒素 四、动物实验,2019/10/18,44,一、免疫学检测,概念辨析,免疫学检测 免疫学诊断 免疫学反应 免疫学技术,血清学检测 血清学反应 血清学技术 血清学诊断,2019/10/18,45,（一）细菌Ag检测,菌体Ag： IFA、荧光菌球法、凝集试验 游离Ag ： ELISA,免疫荧光技术是利用免疫学特异性反应与荧光示踪技术相结合的显微镜检查手段。既保持了血清学的高特异性，又极大地提高了检测的敏感性，在细菌鉴定方面占有重要地位。常用的方法有直接法、间接法和免疫荧光菌球法。,2019/10/18,46,（二）抗体检测,抗体的量常随感染过程而增多，表现为效价的升高。因此用已知的细菌或其特异性抗原检测病人血清中有无相应抗体及其效价的动态变化，可作为某些传染病的辅助诊断。主要适用于抗原性较强的致病菌和病程较长的感染性疾病。,2019/10/18,47,标本：双份血清标本，恢复期比急性期血清标本抗体效价升高4倍方有意义,方法,原理：用已知的细菌或其特异性抗原检测患者体液中相应特异性抗体和其效价的动态变化，可作为某些传染病的辅助诊断。,凝集试验：,沉淀试验：,补体结合试验：,中和试验：,肥达试验、外斐试验,梅毒VDRL、RPR试验等,抗链“O”试验等,Q热柯克斯体抗体检测等,细菌的血清学诊断,2019/10/18,48,二、分子生物学检测,（一）核酸杂交 DNA可进行变性、复性、杂交。利用这一特性，制备特定序列DNA片段，进行标记后用作探针，在一定条件下，按照碱基互补配对原则与标本中已变性的细菌DNA进行杂交，通过检测杂交信号确定是否发生杂交反应，从而鉴定标本中有无相应的病原菌基因。,探针的种类： 克隆片段DNA探针、寡核苷酸探针、质粒DNA探针、rRNA探针、,2019/10/18,49,（一）核酸杂交,2核酸杂交在临床细菌检测中的应用 （1）细菌分类鉴定 （2）细菌快速鉴定 （3）细菌耐药性的检测 （4）细菌毒素的检测 （5）细菌流行病学调查,2019/10/18,50,（二）聚合酶链反应 （ polymerase chain reaction, PCR ）,1. 特异性DNA体外扩增技术 2. 特异、灵敏、快速、操作简便 3. 广泛应用于细菌的鉴定 PCR在临床细菌检测中的应用 1. 细菌的快速检测 2. 细菌毒素的检测 3. 细菌耐药性的检测 4. 细菌流行病学调查,2019/10/18,51,（三）生物芯片技术,1. 通过微加工技术和微电子技术