（浙江专版）2017_2018学年高中生物第一章实验一大肠杆菌的培养和分离教学案浙科版选修1.docx

实验一 大肠杆菌的培养和分离1.培养基中需含有碳源、氮源、水和无机盐等营养物质。2.本实验用LB液体培养基扩大培养大肠杆菌，用LB固体培养基分离大肠杆菌。3.消毒是指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物；而灭菌是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。4.实验室常用煮沸消毒法、紫外线或化学药剂进行消毒；常用的灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌和高压蒸汽灭菌及过滤灭菌等。5.固体培养基的配制过程为：计算称量溶化灭菌倒平板。6.微生物分离接种最常用的方法是划线分离法和涂布分离法。一、微生物1概念：微生物是结构简单、形体微小的单细胞、多细胞或没有细胞结构的低等生物。2利用：生产抗生素，制作发酵食品，治理环境污染等。二、培养基1概念人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出的供其生长繁殖的营养基质。2营养构成各种培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐及生长因子，此外还要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。3培养基的类型(1)按物理性质分：固体培养基、半固体培养基、液体培养基。(2)按目的用途分：鉴别培养基、选择培养基。4微生物生长对特殊营养物质的要求(1)细菌培养基要用蛋白胨和酵母菌提取物来配置，细菌喜荤。(2)霉菌培养基一般用无机物配制或加蔗糖的豆芽汁即可，霉菌喜素。5微生物生长对pH的要求细菌要求在中性偏碱(6.57.5)的环境中生长；真菌要求在中性偏酸(5.06.0)的环境中生长。三、无菌技术1获取纯净培养物的方法获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，具体操作如下：(1)对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进行清洁和消毒。(2)将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等进行灭菌。(3)为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。(4)实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。2消毒和灭菌(1)概念：填表项目方法结果常用的方法消毒较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分微生物(不包括芽孢和孢子)煮沸消毒法、巴氏消毒法、紫外线或化学药物消毒法灭菌强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌、过滤灭菌(2)常用方法：连线四、分离细菌的两种方法比较项目划线分离法涂布分离法工具接种环玻璃刮刀原理划线过程中接种环上的菌液逐渐减少，到划线最后部分细菌间距离加大，经培养后能得到单菌落将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细菌细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落特点方法简单，但单菌落较难分开单菌落更易分开，但操作复杂些目的使培养基上形成由单个细菌细胞繁殖而来的子细胞群体菌落五、大肠杆菌的培养与分离1大肠杆菌(1)特性：革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌。(2)繁殖：以分裂的方式繁殖，分裂速度很快。2扩大培养与分离扩大培养用LB液体培养基，划线分离用LB固体平面培养基。3大肠杆菌分离过程(1)培养基灭菌：50 mL LB液体培养基和50 mL LB固体培养基及培养皿使用高压蒸汽灭菌。(2)倒平板：将培养基分别倒入4个灭菌后的培养皿中，水平放置，使之形成平面。(3)接种：在装有液体培养基的三角瓶中接种大肠杆菌，在每分钟200转的摇床上振荡培养12 h。(4)划线分离：用接种环在接种有大肠杆菌的三角瓶中蘸菌液一次，在固体培养基的平板上连续划线，盖好培养皿。培养皿倒置(盖在下面)，放在37 恒温培养箱中培养1224 h后，可看到在划线的末端出现不连续的单个菌落。(5)培养观察：在无菌操作下将单菌落用接种环取出，再用划线法接种在空白斜面上，在37 下培养24 h后，置于4 冰箱中保存。1下列操作错误的是()A用酒精擦拭双手B用氯气消毒水源C实验操作应在酒精灯火焰附近进行D玻璃器皿(吸管、培养皿)用酒精擦拭灭菌解析：选D对玻璃器皿一般应进行干热灭菌，而不是用酒精擦拭消毒。2下列有关涂布分离法的叙述，错误的是()A首先将菌悬液进行一系列的梯度稀释B将不同稀释度的菌悬液分别涂布到琼脂固体培养基的表面C在适宜条件下培养D都可在培养基表面形成单个的菌落解析：选D涂布分离法是将菌悬液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌悬液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，在适宜条件下培养。只有在稀释度足够高的菌悬液里，聚集在一起的微生物才能被分散成单个细菌，从而在培养基表面形成单个的菌落。3进行恒温培养时为什么要将培养皿倒置？提示：恒温培养时，培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发，倒放培养皿则会使水蒸气凝结成的水滴在培养基表面更好地挥发；如果正放，则水分形成的水滴会落入培养基表面并扩散开。如果培养皿中已形成菌落，则会导致菌随水扩散，很难再分成单菌落，达不到分离目的。4实验完成后，接种过细菌的器皿应如何处理？提示：所有接触过菌的器皿都要先高压灭菌后再洗涤(特别是培养基)；使用后的废弃物也要高压灭菌后再抛弃。1LB培养基的分类及用途2几种常用灭菌和消毒方法的比较灭菌和消毒种类主要方法应用范围灼烧灭菌酒精灯火焰灼烧微生物接种工具，如接种环、接种针或其他金属用具等，接种过程中的试管口或瓶口等干热灭菌干热灭菌箱在160170 加热12 h玻璃器皿(如吸管、培养皿等)、金属用具等凡不适宜用其他方法灭菌而又能耐高温的物品高压蒸汽灭菌100 kPa、121 维持1530 min培养基及多种器材、物品玻璃砂漏斗过滤灭菌玻璃砂漏斗过滤含尿素或葡萄糖的培养基的灭菌煮沸消毒法100 煮沸56 min家庭餐具等生活用品的消毒紫外线消毒30 W紫外灯照射30 min接种室、接种箱、超净工作台化学药物消毒用体积分数为70%75%的酒精、碘酒涂抹，来苏尔喷洒等用于皮肤、伤口、动植物组织表面消毒和空气、手术器械、塑料或玻璃器皿等的消毒3倒平板操作的注意事项(1)打开紫外灯和过滤风，待LB固体培养基冷却到60 左右。(2)关闭紫外灯，点燃酒精灯，用酒精棉球擦拭桌面及双手。(3)在火焰旁右手3指拿锥形瓶，2指拿封口膜。(4)使锥形瓶的瓶口迅速通过火焰。(5)左手将培养皿打开一条缝隙，右手将培养基倒入培养皿，立刻盖上皿盖。(6)待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置。题组冲关1大肠杆菌的培养和分离所用的培养基从物理性质上分别属于()A液体培养基、固体培养基B固体培养基、液体培养基C液体培养基、液体培养基D固体培养基、固体培养基解析：选A培养基从物理性质上可分为固体、半固体和液体培养基。大肠杆菌的分离和培养分别用固体和液体培养基。2下列对灭菌和消毒的理解，错误的是()A灭菌是指杀灭环境中的一切微生物的细胞、芽孢和孢子B消毒和灭菌实质上是完全相同的C接种环用灼烧法灭菌D常用灭菌方法有灼烧灭菌法、干热灭菌法、高压蒸汽灭菌法解析：选B消毒是使用较为温和的物理或化学方法，仅杀死物体表面或内部一部分微生物，不包括芽孢和孢子。灭菌则是使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。3下列有关倒平板操作的叙述，错误的是()A将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上B使打开的锥形瓶瓶口迅速通过火焰C将培养皿打开，培养皿盖倒放在桌面上D平板冷却凝固后需要倒过来放置解析：选C整个倒平板过程要防止外来杂菌的入侵，因此灭过菌的培养皿应放在火焰旁，打开的锥形瓶瓶口应迅速通过火焰，培养皿应打开一条稍大于瓶口的缝隙，而不能将培养皿盖完全打开，平板冷却凝固后需要倒过来放置。4请回答下列与大肠杆菌有关的问题：(1)从生态系统的成分上看，大肠杆菌属于_。(2)下表是某公司研发的一种培养大肠杆菌菌群的培养基配方。成分蛋白胨乳糖蔗糖K2HPO4显色剂琼脂含量10.0 g5.0 g5.0 g2.0 g0.2 g12.0 g将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL该培养基属于_(填“固体”或“液体”)培养基。该培养基中的碳源是_。(3)在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养皿进行_(填“消毒”或“灭菌”)；操作者的双手需要进行清洗和_。空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使蛋白质变性，还能_。(4)将配制好的培养基分装到试管中，加棉塞后若干支试管一捆，包上牛皮纸并用皮筋勒紧放入_中灭菌，温度为_，时间为_。灭菌完毕拔掉电源，待锅内压力自然降到大气压时，将试管取出。如果棉塞上沾有培养基，此试管应_。(5)使用高压蒸汽灭菌锅时注意，先向锅内倒入_。把锅内水加热煮沸并将其中原有冷空气彻底排出后将锅密闭。若在灭菌前，没有排尽锅内的冷空气会导致_。(6)从一支试管向另一支试管接种时注意，接种环要在酒精灯_(填“内焰”或“外焰”)灭菌，并且待接种环_后蘸取菌种，试管口不能离开酒精灯火焰附近，将接种的试管在适宜温度下培养，长成菌落后放入_冰箱中保存。解析：(1)大肠杆菌营腐生生活，从生态系统的成分来看，大肠杆菌属于分解者。(2)表中的培养基配方中含有琼脂，是固体培养基，其中能为大肠杆菌提供碳元素的物质有蛋白胨、乳糖和蔗糖。(3)微生物培养过程中，培养基和培养皿要进行灭菌，操作者的双手要进行清洗和消毒；紫外线杀菌的原理是紫外线不仅能使蛋白质变性，还能损伤DNA的结构。(4)培养基及器材、物品的灭菌应用高压蒸汽灭菌锅，在压力为100 kPa、温度为121 条件下，灭菌1530 min。若棉塞上沾有培养基，易被杂菌污染，应废弃。(5)使用高压蒸汽灭菌锅时要先加入适量水，否则没有高压蒸汽，还有可能损坏设备。(6)酒精灯外焰温度高，灭菌效果好。灼烧后待冷却后再蘸取菌种，否则会杀死菌种造成实验失败。答案：(1)分解者(2)固体乳糖、蔗糖、蛋白胨(3)灭菌消毒损伤DNA的结构(4)高压蒸汽灭菌锅121 1530 min废弃(5)适量水锅内温度上升不到应有度数，使灭菌不彻底(6)外焰冷却4 1平板划线法的操作步骤2涂布平板法的操作步骤(1)操作图示：(2)相关说明：将分别盛有9 mL水的6支试管灭菌，并按101106的顺序编号。用移液管吸取1 mL培养的菌液，注入101倍稀释的试管中。用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸3次，使菌液与水充分混匀。从101倍稀释的试管中吸取1 mL稀释液，注入102倍稀释的试管中，重复步的混匀操作。依次类推，直到完成最后一支试管的稀释。题组冲关5如图是微生物平板划线示意图，划线的顺序为1、2、3、4、5。下列操作方法正确的是()A操作前要将接种环放在火焰旁灭菌B划线操作须在火焰上进行C只有在5区域中才有可能得到所需菌落D在1、2、3、4、5区域中划线前后都要对接种环进行灭菌解析：选D进行平板划线操作之前，要将接种环在酒精灯火焰上进行灼烧灭菌；平板划线操作应在火焰旁进行，不能在火焰上进行；由题图可知，5区域是最后一个区域，有可能在5区域获得所需要的菌落，在4区域也有可能得到所需要的菌落。6现有1 L水样，梯度稀释至103倍。各取0.1 mL已稀释103倍的水样分别接种到三个培养基上培养，记录的菌落数分别为55、56、57个，则每升原水样中大肠杆菌数为()A560个B5.6105个C5.6107个 D5.6108个解析：选D图中稀释的倍数是103，三个菌落的平均数(555657)356，则每毫升样品中菌株数560.11035.6105个，所以每升土壤浸出液中的菌株数5.61051035.6108个。7大肠杆菌是生活在人和高等动物体内的一种常见细菌，在饮用水的检测中常用它作为水源是否受到污染的指示菌，在遗传学上常作为实验材料，在基因工程中常用它作为受体细胞，为人类的健康和科学技术的发展作出了许多贡献。请回答下列有关大肠杆菌的问题：(1)在大肠杆菌培养过程中，除考虑营养条件外，还要考虑_、_和渗透压等条件。由于该细菌具有体积小、结构简单、易培养、_等优点，因此常作为遗传学研究的实验材料。(2)分离大肠杆菌时常用的接种方法是_法和_法。前者操作简单，后者_更易分开，但操作复杂些。(3)培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。对于固体培养基应采用的检测方法是将未接种的培养基在适宜的温度下放置适当的时间，观察_。(4)若用稀释涂布平板法计数大肠杆菌活菌的个数，要想使所得估计值更接近实际值，下列对操作过程说法不妥的是()A严格操作、多次重复B保证待测样品稀释的浓度比较合适C倒平板培养D计数所有浓度梯度下的菌落，取其平均值(5)通常对获得的纯菌种还可以依据菌落的形状、大小、硬度和颜色等_对细菌进行初步的鉴定(或分类)。(6)若用大肠杆菌进行实验，使用过的培养基及其培养物必须经过_处理后才能丢弃，以防止培养物的扩散。解析：(1)大肠杆菌的培养除需要合适的营养条件外，还需要适宜的温度、酸碱度(pH)和渗透压。由于大肠杆菌变异类型容易选择、繁殖速度快，常作为遗传学研究的实验材料。(2)分离微生物常用的接种方法有划线分离法和涂布分离法。前者方法简单，后者单菌落更易分开，但操作复杂些。(3)培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。对于固体培养基应采用的检测方法是将未接种的培养基在适宜的温度下放置适当的时间，观察培养基上是否有菌落产生。若固体培养基被细菌污染，在适宜条件下培养一段时间，细菌会大量繁殖，形成菌落，可根据菌落数量的多少判断污染程度。(4)若用涂布分离法计数大肠杆菌活菌的个数，要想使所得估计值更接近实际值，应该采用倒平板培养，并且严格操作、多次重复，保证待测样品稀释的浓度比较合适。(5)对获得的纯菌种还可以依据菌落的形状、大小等菌落特征对细菌进行初步的鉴定。(6)因为有的大肠杆菌会释放一种强烈的毒素，并可能导致肠道出现严重症状，所以使用过的培养基及其培养物必须经过灭菌处理后才能丢弃，以防止培养物的扩散。答案：(1)温度酸碱度(pH)生活周期短(或繁殖快)(2)划线分离涂布分离单菌落(3)培养基上是否有菌落产生(4)D(5)菌落特征(6)灭菌随堂基础巩固1下列关于培养基的说法，正确的是()A任何培养基都必须含有碳源、氮源、矿质元素、水及生长因子B培养基只有液体培养基和固体培养基C固体培养基中加入少量水即可制成液体培养基D配制培养基时要注意各种养分的浓度和比例解析：选D不同微生物对营养物质的需求不同，如自养微生物的培养基不需要加碳源，自生固氮菌的培养基不需要加氮源。按不同的分类标准，培养基可有不同的种类。配制培养基时要注意各种养分的浓度和比例。2下列操作与消毒、灭菌无关的是()A接种前用酒精灯火焰灼烧接种环B接种前用酒精擦拭双手C将平板倒置，放入培养箱中培养D接种在酒精灯的火焰旁完成解析：选C将平板倒置，放入培养箱中培养与灭菌无关。3采用干热灭菌、灼烧灭菌、高压蒸汽灭菌、紫外线照射等几种方法，可分别用于对哪些器物的灭菌()A接种环、吸管、培养基、接种室B培养皿、接种环、培养基、接种箱C培养基、吸管、接种环、接种箱D培养皿、吸管、培养基、双手解析：选B干热灭菌是将灭菌物品放入干热灭菌箱内，在160170 加热12 h，适用于耐高温且需要保持干燥的物品，如玻璃器皿(吸管、培养皿)和金属用具等；灼烧灭菌是利用酒精灯火焰的充分燃烧层灭菌，如接种针、接种环等；高压蒸汽灭菌用高压蒸汽灭菌锅，一般在压力为100 kPa，温度为121 的条件下，维持1530 min，主要用于培养基灭菌；紫外线照射适用于物体表面灭菌和空气灭菌，如接种室、接种箱、超净工作台等，使用前用紫外线照射约30 min。4将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入37 恒温箱的目的是()A对比观察培养基的成分是否相同B对比分析培养基是否被杂菌污染C没必要放入未接种的培养基D为了下次接种时再使用解析：选B对未接种的培养基进行培养，起到对照作用，可确定培养基是否被杂菌污染。5下列有关平板划线操作的描述，错误的是()A将接种环放在酒精灯火焰上灼烧，直到接种环烧红B接种环在平板上划线的位置是随机的C在挑取菌种前和接种完毕后均要将试管口通过酒精灯火焰D最后一区的划线不能与第一区相连解析：选B将接种环放在酒精灯火焰上灼烧，直到接种环烧红；接种环在平板上划线的位置不是随机的；在挑取菌种前和接种完毕后均要将试管口通过酒精灯火焰；最后一区的划线不能与第一区相连。6下图甲、乙是微生物接种常用的两种方法，请回答相关问题：(1)图甲是利用_法进行微生物接种，图乙是利用_法进行微生物接种。这两种方法所用的接种工具分别是_和玻璃刮刀；对这两种接种工具进行灭菌的方法依次是_和取出放在70%酒精中的玻璃刮刀引燃。(2)平板划线时，为保证微生物的数目随划线次数的增加而逐步减少，每次划线都要从_开始，平板划线结束后，最后一次划的线不能与第一次划的线_。(3)接种操作为什么一定要在酒精灯火焰附近进行？_。(4)下图是接种后培养的效果图解，其接种方法是_(填“图甲”或“图乙”)。(5)假设用图乙所示方法接种培养结束后，发现培养基上菌落连成一片，可能的原因是_。解析：(1)图甲和图乙分别是划线分离法和涂布分离法进行微生物接种，这两种方法所用的接种工具分别是接种环和玻璃刮刀。(2)划线分离时，每次划线前都要从上一次划线的末端开始，最后一次划线不能与第一次划线相连。(3)由于在酒精灯火焰附近存在着无菌区域，因此接种常在酒精灯火焰附近进行。(4)培养基上的菌落分布均匀，接种方法为涂布分离法。(5)采用涂布分离法进行菌种分离时，稀释度要足够高，否则会使微生物不能分散成单个细胞。答案：(1)划线分离涂布分离接种环灼烧灭菌(2)上一次划线的末端相连(或相接、相交、交叉等)(3)火焰附近存在着无菌区域(4)图乙(5)稀释倍数不够，菌液的浓度太高课时跟踪检测对应配套卷P49 1下列有关微生物培养条件的叙述，错误的是()A分离微生物常用固体培养基，扩大培养常用液体培养基B“细菌喜荤，霉菌喜素”，培养基中成分的含量和配比因培养物而异C培养基的灭菌均采用高压蒸汽法D制作固体培养基时常常加入琼脂解析：选C培养基的灭菌通常是采用高压蒸汽法，但因培养基的成分而异。如培养基中有葡萄糖，高压蒸汽条件下会导致葡萄糖分解碳化，而采用500 g/cm2压力灭菌30 min。2获得纯净培养物的最关键环节是()A将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌B接种纯种细菌C适宜环境条件下培养D防止外来杂菌的入侵解析：选D纯净培养物是单一、纯种菌的菌落。因此，确保无其他杂菌的入侵是关键。3金黄色葡萄球菌有很强的致病力，常引起骨髓炎等，还可能引起食物中毒。下述有关接种金黄色葡萄球菌的实验叙述错误的是()A将灼烧的接种环伸入试管内，先接触长菌多的部位B取下棉塞后要将试管口灼烧灭菌C对接种环进行灼烧处理D接种后还要将试管口灭菌加塞解析：选A接种环伸入试管后应先接触未长菌的部位，待接种环冷却后再接触长菌部位。4下列划线分离的图解中，正确的是()解析：选C划线分离的划线有许多要求。A的划线方法不对，而B错在划线2的起点，D项错在4与1交叉了。5要获得遗传特性单一的大肠杆菌菌种，一般必须对原有的大肠杆菌菌种进行扩大培养、并利用纯化技术得到单菌落。请回答下列有关大肠杆菌的培养和分离实验的相关问题：(1)对买回来的大肠杆菌菌种进行扩大培养，一般用LB培养基，在培养基中为微生物提供碳源、氮源和能源的物质主要是_，为调节渗透压，要加入一定量的_。为进行大肠杆菌的分离，还要加入琼脂配制成固体培养基，并进行倒平板的操作。(2)获得纯净微生物培养物的关键是_，为此，必须对培养器皿、接种用具和培养基进行严格灭菌。培养器皿和培养基一般采用_法灭菌，接种环采用灼烧法灭菌。同时在接种或倒平板操作时，除了在超净台上进行操作并对实验者的衣着、手和实验空间进行严格清洁和消毒外，还必须_以防止空气中的杂菌污染。(3)大肠杆菌菌种的扩大培养一般采用液体培养基，接种后将培养基置于37 摇床振荡条件下培养12小时。菌种的分离一般在固体培养基上采用_法，并将培养皿以_状态放置于适宜温度的恒温箱中，培养1224小时后，_，接种于固体斜面培养基上，37 培养24小时后，得到的纯化菌种在_条件下保存。解析：(1)LB培养基的主要成分有蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、水、琼脂，其中蛋白胨和酵母提取物为微生物提供碳源、氮源和能源，氯化钠可以调节培养基的渗透压，琼脂作为凝固剂。(2)微生物纯培养的关键是防止外来杂菌的污染，因此操作过程中要严格灭菌，培养器皿和培养基一般采用高压蒸汽灭菌法灭菌，而接种时要在酒精灯火焰旁进行。(3)大肠杆菌菌种分离采用划线分离法，接种后将培养皿置于恒温箱中倒置培养，以防培养过程中被污染；培养后菌种的保藏方法是：用接种环将单菌落挑出，接种于斜面培养基上，37 培养24小时后置于4 条件下保存。答案：(1)蛋白胨和酵母提取物氯化钠(2)防止外来杂菌的侵入高压蒸汽灭菌保证操作过程在酒精灯火焰旁进行(3)划线分离倒置将单菌落用接种环取出4 6大肠杆菌是生存在人体肠道中的正常菌群，每克粪便中含有109个，且能够与致病菌混杂生长。如果食品和饮用水中出现