红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析-开题报告

毕业设计毕业设计/论文论文 开开题题报报告告 课 题 名 称红豆杉中 MYB 家族基因克隆及表达分析 类别毕 业 论 文 系别城 市 建 设 学 院 专业班生物工程 0701 班 姓名于凯 评分 指 导 教 师 华中科技大学武昌分校 华中科技大学武昌分校学生毕业论文开题报告 学 生 姓 名于凯学号20071171005专业班级生物工程 0701 班 系别城市建设学院指导教师余龙江职称教授 课 题 名 称红豆杉中 MYB 家族基因克隆及表达分析 1 课题研究的目的和意义 1.1 课题研究背景 1.1.1 有关红豆杉 红豆杉是一种濒临灭绝的天然抗癌植物， 由于在自然条件下生长缓慢， 再生能力差， 所以很长时间以来， 世界范围内还没有形成大规摸的红豆杉原料林基地。 中国已将其列 为一级珍稀濒危保护植物，联合国也明令禁止采伐。 红豆杉在全球共有十一种，目前我国共有四种和一个变种，即云南红豆杉、西藏红 豆杉、东北红豆杉、中国红豆杉和南方红豆杉（变种） 。东北红豆杉主要分布在分布于 中国的吉林、辽宁、黑龙江三省，中国境内的红豆杉中，东北红豆杉紫杉醇含量最高， 可达万分之三1。云南红豆杉主要分布在滇西与地洲等地。西藏红豆杉主要分布在云南 西北部、西藏南部和西南部。南方红豆杉主要分布在滇东、滇西南、滇东。 曼地亚红豆杉是我国20世纪90年代中期从加拿大引种而来，原产于美国、加拿大， 是一种天然杂交品种，其母本为东北红豆杉，父本为欧洲红豆杉。引种的曼地亚红豆杉 生物特性稳定，没有发生变异，紫杉醇含量接近甚至高于原产地。我们的实验就是以曼 地亚红豆杉为材料的。 1.1.2 有关紫杉醇 紫杉醇(Taxo1)是2O世纪7O年代初从短叶红豆杉树皮中提取分离得到的一种四环 二萜酰胺类化合物，分子式为：C47H51NO14，是红豆杉属植物中的一种复杂的天然次生 代谢物， 主要由紫杉烷环和侧链组成2， 其生物合成非常复杂， 全过程约20步酶促反应， 涉及多步环化、羟基化、酰基化反应3。 紫杉醇是一种微管特异性药物，它能够稳定微管并阻止微管解聚，使细胞分裂停 止于有丝分裂期，从而抑制细胞的增殖4。临床研究表明，紫杉具有广谱而高效的抗 癌活性，对于治疗卵巢癌、乳腺癌等疗效突出。但是由于含量少、提取困难等诸多因 素，高纯度紫杉醇价格昂贵，每公斤200万元人民币左右。因此，近年来国内外许研究 人员、 实验室和公司一直试图通过生物合成、 化学合成、 微生物提取、 组织和细胞培养、 寻找类似物等途径来解决紫杉醇的药源短缺问题。 研究紫杉醇的生物合成， 尤其一些限速反应步骤机理的阐明对于人为定向的提高合 成效率， 克隆重组形成关键酶基因从而提高紫杉醇的产量意义重大。 从理论上来说这是 一个好方法，但是紫杉醇的合成途径非常复杂，涉及到多种酶以及很多分支途径，单纯 依靠转化一、两种限速酶基因，只能保证转入的限速酶表达量提高，使之不再是限速因 素， 但其它阶段对于最终产量的限制依然存在， 而且同时转入多种基因的可行性非常低， 这种方法的缺陷很明显。 若采用化学合成， 如从红豆杉植物中分离得到的巴卡亭经过四步化学过程可合成 紫杉醇，为合成紫杉醇提供了新途径5。但化学合成从实质意义上说还没有取得彻底的 突破，目前还不具备应用价值。 如果从共生真菌中直接提取紫杉醇， 能够利用真菌生长速度快的优势， 但目前分离 的菌株无论从种类还是数量上都远不够工业化的要求，而且还存在很多不确定因素1。 生产紫杉醇的微生物大多是与红豆杉共生的真菌， 其紫杉醇含量极微， 并且这些真菌的 培养和大规模发酵困难，菌株衰退也是一个难题。 另外， 红豆杉愈伤组织和细胞培养生产紫杉醇是研究的热点之一， 是工厂化大规模 生产紫杉醇的重要手段之一 。但运用植物组织、细胞培养技术生产紫杉醇仍处在实验 室阶段，如何获得高含量、产紫杉醇稳定的愈伤组织一直都是组织培养、细胞培养生产 紫杉醇的关键。 1.1.3关于MYB基因 MYB基因 目前， 在几乎所有的真核生物中都发现了与禽类逆转录病毒癌基因和细胞原癌基因 c-MYB相似的基因，它们的编码产物在结构和功能上具有高度保守的DNA结合域，是 一类转录因子6。在植物中首先从玉米中克隆了含有MYB结构域的转录因子C1基因， 之后在植物中发现的MYB相关基因的数量迅速增加7。 2MYB基因编码蛋白（MYB蛋白）的结构特征 作为一类转录因子，无论在动物和植物中，MYB蛋白均具有高度保守的DNA结合 结构 域以及转录激活域。动物中的MYB蛋白DNA结合域通常含有3个50-55个氨基酸的不完 全重复区，每个重复区折叠成一个螺旋-转角-螺旋（HTH）结构，插入到目标DNA的大 沟中8。 植物的MYB蛋白大多含两个重复区， 分别与动物MYB蛋白DNA结合结构的R2、 R3相似，也发现了有3个重复区及只含有1个重复区的MYB蛋白9。MYB蛋白的DNA结 合结构域集中在氨基端(图1)，每个重复区含有3个在空间上规则排列的色氨酸残基，这 3个色氨酸残基在折叠形成MYB结构域的疏水核心中起重要作用，一般在所有的MYB 蛋白中是保守的，但R3的第1个色氨酸残基可被芳香族氨基酸(如苯丙氨酸)或其他疏水 氨基酸所代替10。 MYB基因的功能 通过转录因子在转录水平上调控目的基因的表达是植物对其生长发育及生理代谢 调控的一种重要方式。MYB转录因子是最大的植物转录因子家族成员之一，几乎参与 了植物发育和代谢的各个方面11。MYB类转录因子可与其它转录因子家族成员尤其是 bHLH类转录因子相互作用，通过组合调控的方式调节植物细胞的形成与模式建成，调 节植物次生代谢特别是苯丙氨酸代谢，并对外界环境、激素及病虫害等做出应答12。 MYB基因的研究进展 自Paz-Ares等从单子叶植物玉米中克隆出与色素合成相关的ZmMYBC1基因以来， 大量MYB类基因从各种植物中得以分离鉴定12。其中在拟南芥中已发现超过198个Myb 家族基因，玉米有超过80个MYB转录因子，而棉花中发现大约有200个MYB转录因子 13。 大量的研究表明，MYB 基因，特别是 R2R3-MYB 基因在参与调控植物次生代谢 途径中的作用至关重要。详细的调控情况见下表14 1.2 研究的目的和意义 先从红豆杉细胞中克隆MYB基因，探索这种基因表达的转录因子与红豆杉细胞中 次级代谢产物紫杉醇的表达量的关系。 从而为构建基因工程植株， 工业化生产紫杉醇提 供依据。 探索红豆杉细胞中转录因子对其次级代谢产物紫杉醇的调控作用， 有利于了解紫杉 醇的生物合成途径， 能够给构建高产紫杉醇的转基因工业化菌种或植物提供方向。 如果 MYB基因的表达确实在调控紫杉醇的合成过程中起到促进作用，接下来就可以建立转 基因植株，以及建立更为期待的转基因工程菌种，为紫杉醇的工业化生产提供思路。这 一方面有利于满足当今社会人们对这种抗癌特效药的需求， 也在另一方面保护了红豆杉 物种，维持了生态平衡，实现了生态的可持续发展。 2 课题研究的主要内容 2.1 本课题研究的切入点 MYB转录因子在多种植物中参与了次生代谢产物的调控，如在苯丙素代谢途径中 的关键调控作用15，以及对于花色素苷的产生起着关键作用16，而且能够有效增强类 黄酮生物合成基因的表达17，等等。目前，许多研究表明，作为代谢途径的关键基因 的转录因子，MYB基因的表达产物对于萜类次级代谢产物的合成至关重要18。紫杉醇 就是一种四环二萜类化合物19，它在红豆杉中的生物合成是否也受到MYB转录因子的 调节，参与紫杉醇生物合成途径的关键酶基因的启动子是否能够被MYB转录因子所识 别，从而调控这些基因的表达。因此，本课题从转录调控的角度，探索红豆杉MYB转 录因子在其次级代谢产物合成过程中的作用，尤其是对于代谢产物紫杉醇的调节作用。 2.2 技术路线 提取曼地亚红豆杉细胞的总 RNA 逆转录合成第一链，得到 ss-DNA 扩增 MYB 基因 序列分析 构建原核表达载体构建亚细胞定位载体构建组成型表达载体 原核表达核内定位建立红豆杉细胞系 以寡聚脱氧胸苷酸 Oligo(dt)为引物，反转录酶催化 以第一链为模板，设计引物，PCR 扩增 染色、标记、电泳，与 Marker 比对 与相应载体连接，重组 DNA 转化红豆杉细胞 3. 研究方法 3.1 研究方案 （1）提取红豆杉总 RNA Trizol 法提取总 RNA 浓度和纯度检测：用紫外分光光度计测定样品 OD260、OD280 和 OD230 的值 以及 OD260/OD280 和 OD260/OD230 的比值。1.0%琼脂糖凝胶电泳检测总 RNA 纯度、完整 性。 （2）逆转录合成第一链 按照反转录试剂盒说明书的方法合成 cDNA 第一链。 （3）利用特异引物扩增 cDNA PCR 扩增程序：95预变性 6min，94变性 40s，55退火 50s，72延伸 90s， 35 个循环后降温 10min，16保温 10min。 （4）序列分析 将（3）中的 PCR 产物与 marker 进行琼脂糖凝胶电泳，对比检验扩增产物，确 定其分子量大小。 回收 DNA。 （5）基因表达分析 采用荧光定量 PCR 技术对回收的基因进行定性和定量分析。 （6）构建原核表达载体，进行原核表达 构建的原核表达载体 pET32a(+),并将 MYB 基因克隆入载体内，经 PCR 和测序鉴 定正确的重组质粒，并在大肠杆菌中进行表达。 （7）构建亚细胞定位载体，胞内定位分析 构建亚细胞定位载体 pCAMBIA1304，基因枪法转入洋葱表皮细胞，通过 GFP 荧 光检测 MYB 基因在胞内定位情况。 （8）构建组成型表达载体 pCAMBIA1303 构建组成型表达载体 pCAMBIA1303,并将 MYB 基因克隆入该载体内，经 PCR 和 测序鉴定正确的重组质粒，瞬时转化红豆杉细胞验证。 3.2 可行性分析 本实验所使用的方法都是建立在分子生物学和基因工程平台上的，我们所在的实 验室正是一个专门研究分子生物学和基因工程实验室，该实验室成熟度技术平台是我 们实验的前提条件；况且余龙江教授所带的团队已经从事红豆杉细胞中紫杉醇合成途 径及其关键基因研究多年，所以我们的目的基因相关序列已近公布，这为我们设计扩 增引物提供了方便。 另外， 实验所要运用到基因工程常用技术， 如反转录构合成 cDNA、 目的基因的 PCR 扩增、目的基因的检测等已经非常成熟。然后，载体构建和原、真核 细胞转化技术也已经非常成熟，不会存在困难。最后，目的基因在转化细胞中的表达 及功能分析，也能够在实验室顺利地进行。 4 实施计划 1-4 周，熟悉研究任务、查阅资料、进行开题报告撰写、开题答辩及外文文献翻译 5-6 周，查阅资料，确定实验方案，准备相关的原料、设备等 6-7 周，MYB 家族基因克隆和序列分析 8-10 周，构建表达载体 11-12 周，表达模式研究 13-14 周，整理数据，分析结论，完成各种数据的分析，完成论文初稿 15 周，根据指导教师修改意见对论文初稿进行修改，并按格式规范定稿 16 周，申请和接受答辩资格审查，进行毕业设计答辩 主要参考文献 1 隋广文、赵海涛等. 东北红豆杉的发展前景与效益分析.药用植物.2010.7，40. 2 杜亚填等.红豆杉植物和愈伤组织培养物中紫杉醇含量的检测.林产化工通迅.2005. 3 张修前.漫谈天然抗癌药物紫杉醇.中学生物学.2009. 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