Apelin通过调节自噬促进脂肪间充质干细胞生存和功能的机制研究-内科心血管博士论文

博士学位论文 Apelin 通过调节自噬促进脂肪间充质干细胞通过调节自噬促进脂肪间充质干细胞 生存和功能的机制研究生存和功能的机制研究 梁 栋 培 养 类 别 全日制 学位类型 学术学位 一级学科(专业类) 临床医学 二级学科(专业) 内科学（心血管病） 研究方向 干细胞分子影像 指导教师 曹丰教授（主任医师） 培养单位 西京医院心血管内科 二 O 一四年五月 第 四 军 医 大 学 The Fourth Military Medical University 分类 号 R543.5 U D C 616.1 密级 公开 独独独独 创创创创 性性性性 声声声声 明明明明 秉承学校严谨的学风与优良的科学道德，本人声明所呈交的论文是我个人在导 师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和 致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，不包含本人或 他人已申请学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 论文作者签名： 日期： 保保保保 护护护护 知知知知 识识识识 产产产产 权权权权 声声声声 明明明明 本人完全了解第四军医大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在校攻读学 位期间论文工作的知识产权单位为第四军医大学。本人保证毕业离校后，发表论文 等使用本论文工作成果时第一署名单位仍然为第四军医大学。学校可以公布论文的 全部或部分内容（含电子版，保密内容除外） ，可以采用影印，缩印或其他复制手段 保存论文；学校有权允许论文被查阅和借阅，并在校园网上提供论文内容的浏览和 下载服务。同意学校将论文加入中国优秀博硕士学位论文全文数据库和编入中 国知识资源总库等，并可浏览和下载，同时享受中国优秀博硕士学位论文全文 数据库出版章程规定的相关权益。 论文作者签名： 导师签名： 日期： 第四军医大学博士学位论文 目目 录录 缩略语表 1 中文摘要 3 英文摘要 6 前 言 9 文献回顾 10 1 干细胞对缺血性疾病治疗的研究 10 1.1 干细胞治疗概述 10 1.2 干细胞在治疗缺血性疾病方面的相关研究 10 1.2.1 骨骼肌成肌细胞 10 1.2.2 全能干细胞 11 1.2.3 外周血祖细胞 11 1.2.4 骨髓干细胞 11 1.2.5 内皮祖细胞 11 1.2.6 心脏原位干细胞 12 1.2.7 诱导性多能干细胞 12 1.2.8 间充质干细胞 12 1.3 干细胞治疗中存在的问题 13 2 自噬在组织缺血及干细胞存活增殖中的调控作用 13 2.1 自噬的概念及分类 14 2.2 自噬发生的过程 15 2.3 自噬的调控 15 2.4 自噬在缺血/再灌注损伤中的作用 16 2.5 自噬在干细胞治疗中的作用 18 2.6 小结 18 3 APELIN促进干细胞存活以及缺血组织的损伤修复 19 3.1 概述: 19 3.2 Apelin 对心血管系统的作用 19 3.2.1 Apelin 的正性肌力作用 19 第四军医大学博士学位论文 3.2.2 Apelin 减少心衰引起的心肌重构作用 19 3.2.3 Apelin 降低血压作用 20 3.2.4 Apelin 的抗缺血再灌注损伤作用 20 3.3 Apelin 的细胞保护作用 20 3.4 Apelin 对自噬的影响 20 4 干细胞分子影像研究 21 4.1 概述 21 4.2 分子影像在干细胞研究中的应用 22 4.2.1 干细胞的 MRI 成像（磁性纳米颗粒标记与示踪） 22 4.2.2 PET 和 SPECT 成像（放射性核素标记与示踪） 24 4.2.3 干细胞的荧光成像 24 4.2.4 荧光分子断层成像(FMT) 24 4.2.5 自发荧光断层分子影像(BLT) 25 4.2.6 生物发光成像（bioluminescence imaging，BLI） 25 4.2.7 干细胞的多模态成像 25 4.2.8 各种成像示踪技术的优缺点比较 26 4.2.9 对干细胞体内致瘤性及安全性的分子影像评价 26 4.2.10 分子影像学在研究干细胞移植免疫排斥反应方面的应用前景 27 正 文 28 第一部分 Apelin 对脂肪间充质干细胞在后肢缺血小鼠体内生存和功能的作用 28 1 材料 28 1.1 实验动物 28 1.2 主要实验仪器 28 1.3 主要实验试剂 28 2 方法 29 2.1 脂肪间充质干细胞分离培养与鉴定 29 2.2 建立后肢缺血动物模型 29 2.3 实验分组 29 2.4 ADMSCs 细胞移植 29 2.5 激光多普勒扫描检测后肢缺血模型血流 30 2.6 生物发光成像检测细胞存活 30 第四军医大学博士学位论文 2.7 荧光素酶活性检测细胞活性 30 2.8 组织学观察细胞在组织内存活 30 2.9 免疫组织化学染色检测新生血管生成 30 2.10 自截肢率评价缺血程度 31 2.11 缺血损伤评分评价缺血损伤改善 31 2.12 活动损伤评分评价患肢功能改善 31 2.13 统计学分析 31 3 结果 32 3.1 激光多普勒成像检测后肢血流恢复 32 3.2 免疫组织化学染色检测组织内新生血管生成 33 3.3 自截肢率统计检测患肢功能恢复 34 3.4 活动损伤评分评估患肢功能恢复 35 3.5 缺血损伤评分评估患肢功能恢复 36 3.6 生物发光成像检测 ADMSCs 在体内生存 37 3.7 荧光素酶活性检测 ADMSCs 在体内生存 38 3.8 组织学检测 ADMSCs 在缺血部位存活 39 4. 讨论 41 第二部分 Apelin 通过调节自噬促进缺氧复氧损伤下脂肪间充质干细胞的生存和功 能 45 1 材料 45 1.1 实验动物 45 1.2 主要实验仪器 45 1.3 主要实验试剂 45 2 方法 46 2.1 脂肪间充质干细胞分离培养与鉴定 46 2.2 建立缺氧复氧模型 46 2.3 实验分组 46 2.4. MTT 法检测细胞增殖能力 47 2.5 生物发光成像检测细胞增殖能力 47 2.6 TUNEL 法检测细胞凋亡 47 2.7 免疫荧光染色检测自噬小体生成 47 第四军医大学博士学位论文 2.8 透射电子显微镜检测自噬小体生成 48 2.9 建立后肢缺血动物模型 48 2.10 激光多普勒扫描检测后肢缺血模型血流 48 2.11 生物发光成像检测 ADMSCs 生存 48 2.12 荧光素酶活性检测 ADMSCs 生存 49 2.13 免疫组织化学染色检测新生血管生成 49 2.14 自截肢率评价缺血程度 49 2.15 缺血损伤评分评价缺血损伤改善 49 2.16 活动损伤评分评价患肢功能改善 50 2.17 统计学分析 50 3.结果 51 3.1 MTT 法评估 Apelin 促进缺氧复氧干预下 ADMSCs 的增殖 51 3.2 生物发光成像评估 Apelin 促进缺氧复氧干预下 ADMSCs 的增殖 51 3.3 TUNEL 法检测 Apelin 对缺氧复氧干预下 ADMSCs 凋亡的影响 52 3.4 免疫荧光染色检测自噬小体中 LC3表达 54 3.5 透射电子显微镜检测自噬小体生成 55 3.6 生物发光成像检测 ADMSCs 在体内生存 57 3.7 荧光素酶检测 ADMSCs 在体内生存 58 3.8 激光多普勒成像检测后肢血流改善 58 3.9 免疫组织化学染色检测组织内新生血管生成 59 3.10 自截肢率统计检测患肢功能恢复 61 3.11 活动损伤评分检测患肢功能恢复 61 3.12 缺血损伤评分检测患肢功能恢复 62 4 讨论 63 第三部分 Apelin 通过调节自噬 AMPK-mTOR-ULK1 与 Akt-Bcl2-beclin1 通路促进 脂肪间充质干细胞生存的分子机制 68 1 材料 68 1.1 实验细胞 68 1.2 主要实验仪器 68 1.3 主要实验试剂 68 第四军医大学博士学位论文 2 方法 69 2.1 建立缺氧复氧细胞模型 69 2.2 实验分组 69 2.3 Westernblot 检测 69 2.4 统计学分析 70 3 结果 71 3.1 Western blot 法检测缺氧与缺氧复氧损伤