PCR技术分离目的基因.ppt

第二节 PCR技术分离目的基因,一 PCR技术,1 PCR的含义 PCR（polymerase chain reaction）：模仿细胞内发生的DNA复制过程，体外大量合成目的DNA片段，包括变性、退火、延伸三个步骤。,2 PCR反应程序： （1）9095模板变性 （2）3760引物与模板复性（退火） （3）7075引物延伸，合成模板链DNA的互补链 循环25-35次,DNA的变性和复性,加热或强酸、碱性作用可以使 DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNA,这称为 DNA的变性。 解除变性的条件后, 变性的单链可以重新结合起来,形成双链,其原有的特性和活性可以恢复,这称DNA复性, 也叫退火。,Kary B. Mullis（1944）,引物,引物,Mullisidea,DNA聚合酶,DNA聚合酶,1983年,Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus),酶活性(%),温度(),40 50 60 70 80 90 100,100 80 60 40 20,1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术,3 PCR反应体系的组成,1）DNA模板 2）引物 引物是指与待扩增的靶DNA两端序列互补的人工合成的寡聚核苷酸（1530bp）。 3）dNTPs 4）耐热性DNA聚合酶 5）反应缓冲液,PCR引物的设计原则: 1.引物的特异性 引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。 2.长度 寡核苷酸引物长度为1530bp。 3.G+C含量 G+C含量一般为40%60%。其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。Tm值最好接近72以使复性条件最佳。,4.碱基础随机分布 引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。 5.引物自身 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。,6.引物之间 两引物之间不应不互补性，尤应避免3端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。,逆转录PCR (RT-PCR) 将mRNA逆转录与PCR技术相偶联的一种基因分离技术。,二 PCR技术分离目的基因,逆转录酶,聚合酶,mRNA,cDNA,杂化双链,PCR扩增,RACE（Rapid amplification of cDNA ends） cDNA末端的快速扩增技术，是以mRNA为模板合成cDNA第一条链后用PCR技术扩增出某个特异位点到3或5端之间未知序列的方法。,3-RACE,5-RACE,思考题： 1 什么是PCR？PCR包括哪三个基本步骤，各步骤的反应温度有什么特点？ 2 PCR反应体系有哪些重要组成成分？什么是引物？引物有哪两种类型？ 3 什么是RACE？它包括了哪两种PCR反应？,目的基因的分离技术： 基因文库技术 PCR技术 插入突变法分离目的基因 图位克隆法分离目的基因（chromosome walking） 酵母双杂交技术分离目的基因 基因芯片技术 蛋白质组学技术 . . . .,第三节 基因的化学合成,在基因的化学合成中，首先要合成出有一定长度的、具有特定序列结构的寡核苷酸片段，然后再通过DNA连接酶的作用，使它们按照一定的顺序共价地连接起来。目前已发展出来的有关寡核苷酸片段的化学合成方法有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法，以及在后二者基础上发展起来的固相合成法和自动化法。,磷酸二酯法（最早创立的DNA化学合成方法） 基本原理：将两个在5或3末端各带有适当保护基团的脱氧单核苷酸连接起来，形成一个两端都被保护的二核苷酸分子。然后此分子脱保护（除去一端的保护基团），再进行新的缩合反应。,Sanger双脱氧链终止法 利用DNA聚合酶和双脱氧链终止物测定DNA核苷酸顺序的方法，是由英国剑桥分子生物学实验室的生物化学家F. Sanger等人于1977年发明的。 它的基本原理是，利用了DNA聚合酶所具有的两种酶催反应的特性： 第一，DNA聚合酶能够利用单链的DNA作模板，合成出准确的DNA互补链； 第二，DNA聚合酶能够利用2，3双脱