造血干细胞移植新进展.ppt

浙江大学医学院附属第一医院 骨髓移植中心 黄河,造血干细胞移植新进展,造血干细胞移植概述,造血干细胞移植历史回顾,1939年，金制剂诱发再障妇女输注血型相同兄弟的骨髓 19世纪50年代，骨髓移植能保护动物死于致死性放疗 随后，临床对一些终末期血液肿瘤患者进行骨髓移植， 1965年，第一例异基因骨髓移植获得成功 1960年以后，HLA系统的发现及HLA配型技术的发展使骨髓移植进入新阶段 Thomas因骨髓移植中的创造性贡献获1990年诺贝尔奖 目前，全球超过10万的病人接受各种造血干细胞移植,造血干细胞移植治疗疾病的机制,以尽可能大的放化疗强度杀灭肿瘤细胞 肿瘤细胞对放化疗有剂量依赖性 放化疗的主要副作用是骨髓抑制 替代 重建造血和免疫功能 免疫机制 移植物抗肿瘤效应（GVT）,造血干细胞移植的分类,移植物类型 免疫学 血缘关系 骨髓移植 自体 亲缘 外周干细胞移植 同基因 非亲缘 脐带血移植 异基因 胎肝细胞移植 异种,病例选择原则,适应症,血液系统恶性肿瘤 CML ALL AML MDS NHL HD MM 血液系统非恶性肿瘤 AA Fanconi 贫血 地中海贫血 PNH 遗传性疾病 重症联合免疫缺陷 先天性代谢异常 实体瘤 乳腺癌 卵巢癌 小细胞肺癌 自身免疫性疾病 SLE 类风湿性关节炎 多发性硬化,造血干细胞移植的术前准备,HLA配型技术,HLA是人类主要组织相容性抗原复合物（MHC） 编码HLA的基因位于第6条染色体短臂P21区，包含400万个碱基，超过200个的基因 HLA类基因（HLA-A、B、C） HLA类基因（HLA-DRB1、DQB1、DPB1）对异基因造血干细胞移植影响最大 HLA基因具有高度多态性 目前为止，已发现的等位基因：HLA-A125个，HLA-B260个，HLA-C225个，HLA-DRB1225个、HLA-DQB140个,HLA配型技术和造血干细胞移植,HLA的血清学配型（1998年前） HLA的基因学配型（1998年以后） 血清学配型相合的患者仍有30%基因学配型不相合 HLA-类基因不合和移植物排斥有关 HLA-类基因不相合和GVHD有关多个HLA-类位点不相合及HLA-、位点都有不合的异基因造血干细胞移植患者长期生存率明显下降,影响急性移植物抗宿主病的发生和严重程度的因素有： 供受者HLA相合程度 女性供者 移植物的来源 移植物中CD34+细胞数量,HLA基因位点相合程度和供者选择,根据患者的疾病类型和疾病阶段选择 对于低危组，常规化疗预期生存时间长的患者，应该选择HLA基因位点完全相合的供者 处于疾病进展期的高危组患者，常规化疗预期生存时间很短，对于这些患者，因为原发病带来的风险比移植更大，可以选择1个基因位点不合的供者，甚至1个抗原位点不合、2个基因位点不合的供者,造血干细胞移植的预处理,预处理的目的,最大程度地杀灭白血病细胞及肿瘤细胞（对白血病及恶性肿瘤而言） 抑制机体的免疫功能以减轻受者对植入造血干细胞的排斥反应，以利造血干细胞的顺利植入 使受者骨髓龛腾空，以利造血干细胞的“归巢”和植入,经典预处理方案,Bu 1mg/kg/q6h CY 50mg/kg/d Bu-CY -7,-6,-5,-4d -5,-4,-3,-2d 总剂量16mg/kg 总剂量200mg/kg 改良Bu-CY 同上 CY 60mg/kg/d -3,-2d 总剂量120mg/kg TBI-CY TBI 200cGY，Bid CY60 mg/kg/d -3,-2,-1d -5,-4d 总剂量12GY 总剂量120 mg/kg,造血干细胞的采集、处理和输注,一、异基因骨髓移植,采髓 麻醉：连硬或全麻 位置：髂后上棘 总量：10-20ml/kg 有核细胞数：2-3108/kg CD34+细胞数：2106/kg CFU-GM：2105/kg,异基因骨髓移植,输髓 复核有核细胞数、CD34+细胞数、CFU-GM 细菌学、病毒学检查 输髓一般在24小时内进行 注意监测病人生命体征变化 鱼精蛋白中和肝素,异基因骨髓移植,供受者ABO血型不相合骨髓的处理 供受者ABO血型次要不相合的处理 测定供髓者凝集素效价，以决定是否去除供髓中的血浆 供受者ABO血型主要不相合骨髓的处理 去除供髓中的红细胞 重力离心沉降法 血细胞分离机 对受者进行血浆置换 供受者ABO血型主次要均不合骨髓的处理 同时采取上述两种方法,二、异基因外周血造血干细胞的动员和分离,动员方案 G-CSF:10g/kg/d 采集时间：应用G-CSF后4-5天 采集仪器：血细胞分离机 采集细胞数要求 有核细胞数6-8108/kg CD34+细胞数2106/kg CFU-GM2105/kg,三、自体外周血干细胞移植的动员、分离和净化,动员方案 化疗+G-CSF 采集时间、仪器、采集细胞要求同异基因外周血干细胞移植 冻存 净化 CD34+细胞分选 单克隆抗体，如美罗华（抗CD20） 药物，如4-HC,四、脐血采集、处理和保存,脐血来自正常足月分娩胎儿的脐带和胎盘 分离脐血单个核细胞 加适量冻存保护剂 计算机程控速率（1/min)降至-80 置-196液氮长期保存,造血重建的植入证据,造血重建的植入证据的常规方法,红细胞抗原 ABO、Rh等血型抗原 白细胞抗原 HLA-类抗原 红细胞和白细胞同功酶 免疫球蛋白 同种异型免疫球蛋白谱测定 细胞遗传学分析 供受者性别不同可行性染色体检测,造血重建的植入证据的分子遗传学分析,限制性片段长度多态性分析（RFLP） PCR指纹图 特异的分子探针杂交 短串联重复序列多态性分析目前最先进最可靠的造血干细胞移植植入检测方法,造血干细胞移植并发症的 预防及治疗,造血干细胞移植的主要并发症,感染 出血性膀胱炎 肝静脉闭塞症(VOD) 移植物抗宿主病（GVHD） aGVHD cGVHD 植入失败,全环境保护（total environment protection，TEP）,目的 尽量减少患者体内致病菌的负荷，以使BMT中感染的发生率降到最低程度 措施 口服不吸收抗生素 皮肤清洁消毒和眼、鼻、耳、口腔、脐、阴道等部位 的消毒 进无菌饮食 住空气层流病房（LAFR）,各种病原体感染的防治,病毒感染的防治 更昔洛韦或无环鸟苷，大剂量免疫球蛋白 CMV引起的间质性肺炎：更昔洛韦加免疫球蛋白 细菌感染的防治 预防性应用抗生素 集落剌激因子促进粒细胞恢复 治疗：联合足量应用广谱抗生素，根据细菌培养药敏结果调整抗生素 霉菌感染的防治 氟康唑或制霉菌素片 治疗：二性霉素B、大扶康,巨细胞病毒（CMV）感染的防治,巨细胞病毒感染是异基因骨髓移植病人死亡的主要原因之一 CMV感染的临床症状缺乏特异性，诊断主要依靠实验室检查 实验室检查 找包涵体和组织培养 CMV抗体 定性PCR方法检测CMV-DNA CMV-PP65抗原测定 治疗 更昔洛韦 磷甲酸钠,肝静脉阻塞病（VOD）,定义 肝内小静脉阻塞肝细胞和肝血管损伤而致的移植相关并发症 发生率4-53% 发病机制 谷胱甘肽的清除 炎症介质 凝血机制 纤溶机制 临床表现 黄疸 肝脏疼痛性肿大 进行性腹水和体重增加,肝小静脉闭塞病的危险因素有： 高强度预处理； 肝功能异常； 活动性肝炎；,肝静脉阻塞病（VOD）,预防 避免在ALT升高的基础上行BMT 肝素 前列腺素 熊去氧胆酸 谷胱甘肽前体 N-乙酰谷氨酸 左旋谷酰胺 治疗 加强护肝治疗 严格控制液体入量 适当利尿 白蛋白提高胶体渗透压,GVHD概述,发生率及后果 HLA相合的亲缘异基因造血干细胞移植 30%-60% HLA相合的无关供者异基因造血干细胞移植:40%-90% 与aGVHD直接或间接有关的移植相关死亡率高达50% 在长期存活的病人中，仍有60%-80%发生cGVHD 分类 移植后100天内发生的GVHD称aGVHD 移植后100天后发生的GVHD称cGVHD,造血干细胞移植中预处理相关毒性导致的晚期并发症有： 儿童生长缓慢； 淋巴细胞增殖性疾病； 白内障； 继发肿瘤；,aGVHD的预防,增加HLA配型的精确程度 药物 经典方法:CsA+MTX GVHD预防的新药:MMF, FK-506, ATG T细胞去除术 体外去T,如:CD34+细胞纯化 体内去T,如:自杀基因导入 选择性去T,如去除CD8+亚群 共刺激通路阻滞,aGVHD的治疗,甲基强的松龙 调整CsA剂量，使其血药浓度维持在较高水平 全环境保护 抗感染治疗 支持治疗 二线药物： MMF、 ATG、抗CD3单抗、FK-506,植入失败的诊断,植入失败分原发植入失败和继发植入失败两种 原发植入失败 在移植后存活超过28天的病人在死亡时或第二次移植前，不能达到中性粒细胞绝对值0.5109/L。 继发植入失败 植入后，中性粒细胞绝对值又降到0.5109 /L以下,植入失败的影响因素,HLA位点 移植物造血干细胞的质和量 移植物去T细胞 造血微环境 预处理方案 移植前多次输血 骨髓纤维化，脾肿大影响归巢 移植并发症：CMV，EBV，GVHD,造血干细胞移植植入失败的预防,植入失败的治疗,细胞因子 GM-CSF G-CSF 二次移植 自体移植 异基因移植,自体造血干细胞移植,自体造血干细胞移植的优缺点有： 并发症少； 技术难度和费用低； 复发率高,自体造血干细胞移植后复发的根源是： 无GVL效应； 移植物中可能含有肿瘤细胞； 预处理不能有效杀灭体内残留肿瘤细胞；,HLA单倍体相合造血干细胞移植,HLA单倍体相合造血干细胞移植的成功障碍及解决方案,克服HLA单倍体相合造血干细胞移植障碍的主要方法：大剂量CD34+细胞移植,大剂量CD34+细胞移植的理论基础 大剂量造血干细胞移植物中具有“否决”细胞（veto cell）, “否决”作用即能破坏特异性针对自身MHC-I 类抗原的细胞毒性T细胞前体细胞（CTL-p） 增加移植物中造血干细胞量，可加强与宿主体内残存干细胞竞争力，从而有利于移植物植活 大剂量造血干细胞可诱导宿主对移植物的免疫耐受,HLA单倍体相合造血干细胞移植的评价,单倍体骨髓移植对于未能找到HLA相合的同胞供者的病人而言是一个可行的选择 尽管临床经验有限，最近的数据还是令人鼓舞的 大剂量CD34+细胞可使移植物快速植入，在一些T细胞去除的移植中，NK介导的GVL效应可能存在，使复发率下降 移植后感染并发症仍是单倍体造血干细胞移植尚未克服的主要的障碍，最有希望的是过继细胞免疫治疗,减低剂量造血干细胞移植,减低剂量预处理的提出,以往 移植前超大剂量放化疗对预防移植物排斥是必需的 移植前高强度放化疗使造血干细胞移植仅限年龄较轻，一般情况较好的患者 最近 高效免疫抑制剂氟哒拉宾（fludarabine)的使用 GVT 机理研究的加深 许多研究者开始探索强度较弱预处理方案,减低剂量预处理方案的适应症-ASH,NST病例选择的总原则 移植物抗肿瘤效应敏感的肿瘤 必须在原发病进展前产生GVL效应 NST病例选择 处于缓解期的高危AML 惰性肿瘤：CML慢性期、低度恶性淋巴瘤 不适合NST的病例 原发病进展迅速，如：难治性急性白血病、CML急变 对GVL不敏感，如：ALL、高度恶性淋巴瘤,减低剂量造血干细胞移植-小结,能保证供者造血干细胞的植入，产生GVL效应 对GVL敏感的肿瘤是一种潜在的、有效的治疗方法 降低了预处理方案相关死亡率，为年龄较大的病人、难以耐受强烈预处理的病人提供了异基因造血干细胞移植的机会 GVHD发生率较高（50%左右），复发仍是主要问题,减低剂量造血干细胞移植-未来展望,如何在减轻GVHD基础上加强GVL效应，进一步提高非去髓性造血细胞移植的疗效 进一步确定非去髓性造血干细胞移植的适应症 多中心的临床对照试验对传统预处理方案和减低剂量预处理方案的造 血干细胞移植的疗效进行比较,GVL和GVHD的分离的新策略,过继性T细胞治疗的提出,DLI可使部分患者获 CR，进一步证明了GVL效应的巨大潜力 CMV、HIV、EBV、黑色素瘤抗原特异性T细胞输注的临床试验已证实其安全性和有效性 已经建立过继T细胞治疗的原则 目前主要问题是有效分离抗肿瘤、抗宿主反应的抗原,过继输注T细胞的靶抗原,次要组织相容性抗原（mHAg),肿瘤特异性抗原(PR3 WT-1),mHAg的初步研究,Riddell等对38个以前从来未报道的mHAg的特征进行了研究，发现有的mHAg仅在造血组织中表达 从异基因造血干细胞患者体内分离CD8+mHAg特异性T细胞克隆 T细胞克隆溶解患者造血系统来源的细胞，而不溶解患者的纤维母细胞,mHAg的初步研究,Mutis等进行了mHAgs特异性T细胞输注的临床研究 研究对象：异基因造血干细胞移植后复发的白血病患者 分离并过继输注供者mHAgs特异性T细胞 T细胞克隆都转染了单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷酸自杀基因 初步的结果显示接受这种治疗的患者获CR，而不增加GVHD的发生率,肿瘤特异性抗原,mHAg的使用仅限于异基因造血干细胞移植的患者 一个可供选择的方法是鉴别和肿瘤表型相关的抗原，作为T细胞治疗的靶目标,肿瘤特异性抗原-蛋白激酶3（PR3）,PR3是一种中性的丝氨酸蛋白激酶，主要在髓系分化的早幼粒阶段表达 PR3在白血病祖细胞（特别是CML）上表达，而在正常造血干细胞不表达 PR3特异性CD8+CTL选择性溶解白血病原始细胞，但对正常细胞无明显影响 PR3特异性CD8+CTL在正常人及未经治疗的CML患者外周血上检测不到，在异基因造血干细胞移植或-干扰素治疗的患者中能检测到，提示这些细胞在抗肿瘤免疫中起重要作用,肿瘤特异性抗原-Wilms瘤抑制物（WT