以端粒酶为靶点的AD治疗策略的体外实验研究.doc

中山大学博士学位论文以端粒酶为靶点的AD治疗策略的体外实验研究姓名：孔令平申请学位级别：博士专业：人体解剖与组织胚胎学指导教师：汪华侨20090530 以端粒酶为靶点的治疗策略的体外实验研究孔令平师：汪华侨教授人体解剖与组织胚胎学中枢神经退行性疾病的基础研究琓还具有独 材料与方法 钚约觳馐约梁分光光度计试咏幌赴肆富钚缘谋浠按萍馗稍云鋒的影响检测盯的表达。电镜下可见细胞线粒体肿胀变圆，基质消失，变成只剩外壳的“鬼影样”结构， 丝塑挂醒蕴把虚鲤箜渔痘筮堕的佳处塞坠堑峦密度低呈斑片状，嵴变形扭曲甚至断裂、数量明显减少、分布不均；而在培养早期，试咏幌赴缓倭恳斐吡澹慌嘌砥贑胞质杂交细胞线粒体形态正常，与培养早期差别不大；细胞线粒体呈圆的空泡状或“鬼影样”结构，与培养早期无明显变化。一 显著升高；的表达； 瓹： 琣 轛 甅瓹 豦 疞甅 琩，瓾瑃 琒甋 电子传递链究凇尬籱啕菇馒瑚髓辌痵一一 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。日 珹是年由德国精神病学家和神因及发病机制，寻找有效的防治措施，已成为亟待解决的社会问题。关于的用机制已成为研究的热点，这为神经退行性疾病如的防治策略带来新的亮 蔽侍狻緇们。而端粒酶可维持端粒的长度避免端粒如、等端琓。其中为端粒酶的水平和 的表达显著升高，其分析后发现舳由嫌辛礁龃萍胤从，芴匾旖岷螮倍呓岷虾螅舳痟的转录。也有人发现部赡懿斡肓舜萍丶疃肆傅淖B肌俊萍啬芄患預从而刺激虻谋泶锖偷鞍椎牧姿峄。总之，雌激素激活端粒酶的活性可能有多种途径的参与，具体机制有待更深入的研究。 线粒体是细胞中能量储存和供给场所，它提供生命活动所需能量的。线琑牟哂质荝 随着衰老的进行，龆啵斐商逑赴鹠突变和缺失，导致呼吸链相关化酶的异常，从而引起脑代谢异常，增力垂从钟跋靘的损伤，加重氧化应激，如此反复最终导致的发生。大量研究证明患者线粒体出现大量形态、生物化学以及生理相关指标的异常。患者脑能量代谢异常，在患者脑组织和周围细胞P“搴统上宋赴中均发现，其线粒体的能量代谢和呼吸链出现异常，尤其是钚越档汀敬俊缱臃涠喜闵显示脑内能量代谢异常与的发病密切相关【恰颊吣灾校趸鹕讼扔趐淀粉样沉淀出现【】。患者死后尸检发现脑组织中存在大量的氧化蛋白、脂质、蚏萬他铡用胞质杂交技术构建出胞质杂交细胞，通过电镜观察发现胞质杂交细胞的线粒体形态异常，富钚越档停珹水平减少和氧化应激增强。通过对死后患者的脑组织进行生化分析结果显示，线粒体内三羧酸循环的三个主要酶活性出现不同程度的损害：丙酮酸脱氢酶复合物 神经元损伤的神经保护作用有保护效果，同时从线粒体的功能改变中进一步探讨其可能机制。主要试剂胎牛血清胰酶杭州四季青公司 抗体解剖显微镜美国畉美国人胚胎皮质神经元的培养 牛血清白蛋白教G脚鞑咛狧液中运输至无菌操作台；一 笥庀晕迪鹿鄄觳扑阕H韭省鄄欤玀定为。琾腜稀释，荧光显微镜观察结果。一 畆。尤作用罩古嘌的，振荡一 正常对照组荧光值的百分比值。每次实验各组细胞分别检测。测定试剂盒说明书进行操作，最后，在酶标仪中测定波长的吸光值。细每次实验各组细胞分别检测。数据统计学分析一一 并不增高，且死亡细胞较多，故以后的实验均以进行病毒转染。腺病人约基本消失。免疫细胞化学染色展示谋泶镆彩窃谧H竞瘄罔俑咀H救伺咛噬窬:骽的表遮；篏 曩耋舏：甀尸 图伺咛噬窬猂水平的变化甌较没有明显的变化。 甴一 通过溴化乙锭处理细胞制备笔赴细胞侔裇患实验对象者采用疌砌诊断标准：一 ；所有采用对象均遵循知情同意和有关伦理要求。主要试剂胎牛血清胰酶溴化乙锭其余试剂均由中山大学设备处治龃提供。电子天平北京赛多利斯天平有限公司美国甊 溶液的配置：，去离子水。先将譯丙酮酸尿苷或其尽快融化：加蹲笥褼嘌海次。一 组硪蛔榧乙锭的细胞为对照组同条件培养。血小板：弃上清，血小板沉淀中加入培养液，计数，调整血小板浓度至。胄合时间总共为后，立即加入入，培养箱培养，甅代替血小板进行模拟融合，余条件相同。灰次，融合后第丙酮酸和尿苷笤嫉合细胞数量明显开始减少，当其少于个细胞时，筛选结束，胞质一 杂交细胞构建完成。胄尤瞿康幕駽亚基一 镉琼脂糖凝胶电泳分析。图像扫描、保存。去铀，各超薄切片机切片，切片厚姗；姿嵊耍坶谒崆旧直鹑透射电子显微镜观察。拍片。一 死亡细胞明显增多，生斩燃趼纫组为甚，随着培养时间的增组作用一抓一 篘胂；篘 螅鋗己完全缺失，故命名为细胞； 能的机制。细胞细胞主要试剂一一 检测试剂盒公司上海杰美基因医药科技有限公司南京凯基生物有限公司凝胶成像系统细胞培养箱日本透射电子显微镜细胞培养详见第一章一一 细胞组细胞活性法赴诨钚匝跛胶虶含量检测详见第一章。取上线粒体细胞色素趸改芙乖偷南赴豤峰;Q趸拖赴豤还原型细胞色素姆从逑抵屑尤敫髯檠罚尤胙泛钪捣从赴谻氧化酶的活性。根据前述一 胄；瑃疞，現的滴析得到发高强度红色荧光的细胞的百分率。激光共聚焦显微镜观察痬拿芏戎钟诙嗑劾蛋彼岚坏南靖遣希湃一 现细胞及试咏幌赴纳俾时饶副鞠赴鸖屯诙哉誄一 篊 甊甀尸、，瓹细胞内氧自由基水平的变化一 和图荆嘌缙赟胞质杂交细胞组的到贤贑胞质杂交细胞降低丁琍脚嘌砥冢瑂胞质杂交细胞则比同期试咏幌赴陆礣 ：阁培养早晚期备组细胞含馈甤性；差片有统汁学意义琍 。异有统计学意义籔”细胞的膜电位在 奚昕趃，：菩篘：篖緂 。图中所见细胞中发红色荧光的颗粒为膜电位水平高的线粒体，绿色荧光颗粒为膜电位水平低的线粒体，黄色荧光颗粒为红色荧光和绿色荧光的重叠，表示膜电位水平中等的线粒体。培养晚期试咏幌赴图和细胞胞质中均以红色荧光颗粒为砻魉堑哪缥凰浇细撸篠胞质杂交细胞中则以黄色荧光颗粒为主，还有少鹭噪色和红色荧光颗粒，表明它 预对其的影响功能还需进一步探讨。和的表达来探讨雌激素的可能作用。一一 电子天平北京赛多利斯天平有限公司 中科美菱上海森信公司实验分组一一 各种细胞分为以下三组：细胞组端粒酶活性检测清；一 鲜龇从逑抵屑尤雔“獗昙且铮琹增：引物序列：面；点预电泳盖子，防止电泳液蒸发，关门；贑械慊鱐，双击娼和迹J嫉缬试剂，一 应体系如下：一一 美国，为统计时最终需要的数值。用软件设计引物，由中山大学达安基因公司合成。序列如下：离心一 軦电泳电泳酥胶虸张膜；裀湃爰状贾薪。尤： 一 号蠹达明显低于细胞，差异有统计学意义琍 差异有统计学意义达与的表达差别不大。培养晚期试咏幌赴鹔一；。一。 异有统计学意义甈试咏幌赴蚦胞质杂交细胞。 笃鋒的表达显著增高，与未干预胞与未千预组比较变化不明显。珻琁琹籇。弧甈 是矸垩疤宓鞍经肛分泌酶和丫障碍，膜电位降低，线粒体膜通透孔的开放，细胞色素却俚蛲龅鞍资头牛盏嫉蛲龅姆可能涉及多种途径和因子，如、一 细胞，等【溆痬细胞。耗一 统晒菇鯬赴萒缩短了约三分之眒还没完全耗损干净，后来我们把其中一瓶细胞改加溴化乙锭，结果再作用 丝塑拉醒蕴把盛竣堂渔痘筮堕丝佳筮塞坠婴塞细胞的膜电位明显低于母本细胞，细胞的膜电位要明显低于母本细胞；而萬观察果显示在培养早晚期细胞的膜电位比母本细胞的要低，但差别没有统计学意 体直接来源于颊撸谂嘌讨行翁艿母谋渫隒胞质杂交从而为阐明有关的线粒体发病机制提供细胞模型。线粒体在细胞生物能量的产生中处于中心地位，过去的多年的研究表明线粒体氧化磷酸化功能异常在神经退行性疾病的发病中起了重要作用。线粒体变性一 验的结果为阐明发病的原因之一线粒体的级联学说提供了一个有力的证会加重乃鹕恕臼笛榈难芯拷峁砻鱏胞质杂交细胞在培养早期，一 差别不大，但到培养晚期，试咏幌赴亩肆富钚裕琱对此原因尚需进一步研究证实。舳由嫌辛礁龃萍胤从 的表达需要线粒体的参与，氧化磷一一 近来研究发现在氧化应激状态下，不管内源或外源性端粒酶均会被核排除进一 以端粒酶为靶点的基因治疗策略提供理论基础和实验依据。结果小结如下：结构和功能加速异常，其细胞活力、钚浴含量和膜电位显著下降，不大。一 参考文献甈甅甆甆，：沤啵艋G龋肆赣階病国外医学内科