一种适用于PCR 的土壤微生物DNA 的提取方法[J].doc

文库下载 免费文档下载/本文档下载自文库下载网，内容可能不完整，您可以点击以下网址继续阅读或下载：/doc/d946ed53f01dc281e53af0a7.html一种适用于PCR的土壤微生物DNA的提取方法非常好的一种方法。安徽农业科学,JournalofAnhuiAgr.iSc.i2010,38(2):600-601,619责任编辑?李菲菲?责任校对?傅真治一种适用于PCR的土壤微生物DNA的提取方法李惠敏,胡雪英,秦新民*?(广西师范大学生命科学学院,广西桂林541004)摘要?目的对土壤微生物的DNA进行提取,以建立一种适用于PCR技术分析的土壤微生物DNA的快速提取方法。方法采用了2种不同的直接裂解法提取土壤微生物DNA,并用细菌通用引物27F和1492R进行PCR扩增16SrDNA片段。结果2种方法提取的土2 壤微生物总DNA电泳结果显示没有差别,但是只有CTAB、溶菌酶、冻融裂解法提取的总DNA不需要纯化,在增加Mg用量的条件下,只需用第一轮非特异PCR产物作为模板即可扩增出16SrDNA片段。结论CTAB、溶菌酶、冻融裂解法提取土壤DNA,方法操作简单、快捷,同时适用于PCR分析,为土壤微生物群落结构的多样性分析奠定了基础。关键词?土壤微生物DNA;提取;PCR;16SrDNA中图分类号?S154.34?文献标识码?A?文章编号?0517-6611(2010)02-00600-02AnExtractionMethodofSoilMicrobialDNAforPCRAnalysisLIHui?minetal?(CollegeofLifeScience,GuangxiNormalUniversity,Guilin,Guangxi541004)Abstract?ObjectiveTheamiofthisstudywastoextractDNAfromsoilmicroorganismsandestablishtherapidextractionmethodofsoilmi?crobialDNAforPCRanalysis.MethodTwokindsofdifferentdirectpyrolysismethodswereinvestigated.16SrDNAwasamplifiedwithbacterialuniver/doc/d946ed53f01dc281e53af0a7.htmlsalprmiers27Fand1492RbyPCR.ResultTheelectrophoresisresultsoftotalDNAfromsoilmicroorganismsbytwokindsofDNAex?tractionmethodshadnodifference.WithoutpurificationofTotalDNAextractedbyCTAB,lysozyme,freezingthawpyrolysismethod,thefirst?cycle2 non?specificPCRproductscouldbeusedasthetemplatetoamplify16SrDNAfragmentsundertheconditionsofaddingMgamoun.tConclu?sionSoilDNAcouldextractedbyCTAB,lysozyme,freezingthawpyrolysismethod.Themethodwassmipleandfastinoperation,suitableforPCRanalysis.Theresearchprovidedthebasisforthediversityanalysisofsoilmicrobialcommunities.Keywords?SoilmicrobialDNA;Extraction;PCR;16SrDNA?土壤是微生物栖居的主要场所,微生物在土壤中的分布及生命活动与土壤肥力、植物营养、植物病害和植被状况等密切相关。因此,研究土壤微生物群落和多样性对有机物的形成和分解、土壤监测与生态环境改善等方面有着重要的意义。现在广泛公认在环境样品中只有0.001%15.000%的微生物具有可培养性,其中土壤约为0.300%,活性污泥约为11.000%15.000%。因此,利用传统微生物学分离纯化培养的方法来检测环境样品中的微生物会极大地低估样品中微生物的多样性。随着分子生物学的理论与技术在微生物生态学研究中的不断渗透,微生物多/doc/d946ed53f01dc281e53af0a7.html样性的研究有了新的突破。而以16SrRNA序列分析作为微生物分类系统的主要依据也得到了广泛认同。由于土壤的理化成分复杂,在提取的过程中含有较多的抑制成分,如腐殖酸、酚类化合物、重金属离子等,其中又以腐殖酸和腐殖酸类似物的抑制作用最明显,它们主要通过干扰裂解、使核酸降解或非特异性吸附和抑制酶活性的方式起作用。总之,从土壤环境中高效地获得微生物基因组DNA具有相当的难度,所提取DNA的质量将在很大程度上影响后续的PCR、酶切等的研究工作3-421.1.2?试剂与仪器。TENP缓冲液(pH值8.0):50mmol/LTris,20mmol/LEDTA,100mmol/LNaC,l1%(W/V)PVP。DNA提取液 (pH值8.0):100mmol/LTris,100mmol/LED?TA,200mmol/LNaC,l2%(W/V)PVP,2%(W/V)CTAB。DNA提取液!(pH值8.0):100mmol/LTris,100mmol/LED?TA,100mmol/L磷酸钠,1.5mol/LNaC,l1%CTAB,2?Cl2,1?g/mlBSA。SigmaK?38高速冷冻离心机;GL?20G?!型高速冷冻离心机;FR?980生物电泳图象分析系统(上海复日);HH?S恒温水浴锅;DYY?5型稳压稳流电泳仪;PCR扩增仪(AppliedBi?osystems)。1.2?试验方法1.2.1?土壤微生物DNA的提取。?玻璃珠、溶菌酶和SDS裂解法。参照李长林等的方法略有改动:取0.5g土壤置于灭过菌的2ml离心管中,加入1.5mlTENPbuffer,1000r/min离心5min,弃上清液,取沉淀。加入0.2g直径约1mm的玻璃珠和0.6mlDNA提取液 ,旋涡振荡10min。加入50?l溶菌酶(100mg/ml),充分混匀,37?水浴2h,期间颠倒离心管4次。加入0.5ml2%的SDS缓冲液,68?水浴40min,隔10min颠倒离心管1次。1000r/min离心10min,取上清液。/doc/d946ed53f01dc281e53af0a7.html在上清液中加入等体积的氯仿/异戊醇(24?1),颠倒混匀,静置10min。10000r/min离心15min,收集上清液。在上清液中加入0.5倍体积25%PEG6000,4?放置过夜,12000r/min离心10min,沉淀用70%乙醇洗涤,8000r/min离心5min,沉淀室温晾干,溶于30?l双蒸水中,备用。?CTAB、溶菌酶和冻融裂解法。参照李钧敏等的方6法略有改动:取土壤样品0.5g,置于灭过菌的2ml的离心管中,加入1.3ml12%(W/V)磷酸钠,高强度旋涡振荡10min。10000r/min离心5min,取沉淀,再次加入1.0ml12%,离心in,5。因此,无论是土壤宏基因组文库的构建还是土壤微生物的分子生态学研究,提取土壤微生物基因组DNA是研究开始的关键。1?材料与方法1.1?试验材料1.1.1?DNA提取材料。DNA提取材料的采样地点位于广西师范大学植物园。采样地点的土地利用类型为菜地,种植小白菜。采样时间是2008年11月,采集菜地中表层的土壤,采集深度为010cm,用塑料袋封装带回,密封在-20?下保存。基金项目?广西师范大学第三批青年骨干教师资助计划(2007)。作者简介?李惠敏(1978-),女,广西北流人,硕士,讲师,从事分子生物学的教学与研究工作。*通讯作者。收稿日期?2009?09?0738卷2期?李惠敏等?一种适用于PCR的土壤微生物DNA的提取方法601入0.8ml12%磷酸钠洗涤,混匀。10000r/min离心5min,取沉淀。加入DNA提取缓冲液!,混匀,再加入50?l溶菌酶(100mg/ml)颠倒混匀,37?水浴1h。65?水浴1h,中间反复冻融3次。10000r/min离心10min,取上清。加入等体积的氯仿/doc/d946ed53f01dc281e53af0a7.html/异戊醇抽提,12000r/min离心10min,取上清。DNA的沉淀同#?的PEG6000法进行沉淀。1.2.2?DNA质量检测。?电泳检测总DNA质量。琼脂糖凝胶电泳初步检测总DNA质量7EF)。虽然以CTAB、溶菌酶和冻融裂解法提取的总DNA为模板第1次PCR并没有特异性扩增产物,而以此产物2.0?l为模板,在PCR缓冲液中已含有Mg的情况下,在20.0?l2 反应体积中再加入2.0?l的Mg量进行PCR即可得到预期大小的16SrDNA的特异条带。2 ,经电泳分离且染色后的凝胶直接在复日科技FR?200生物电泳图像分析系统上拍照并分析所提取DNA的质量。?16SrDNA的PCR扩增。用于扩增16SrDNA基因的细菌通用引物:27F(5%?AGAGTTTGATCCTGGCTCAG?3%)和41492R(5%?TACCTTGTTACGACTT?3%),由上海捷瑞生物工程有限公司合成。以广西师范大学生命科学学院实验室平板培养的大肠杆菌单菌落直接作为PCR反应的DNA模板,建立16SrDNA的扩增反应体系。模板DNA(从平板上挑取大肠杆菌单菌落),TaqDNA聚合酶0.5?l(2.5U),10&PCR缓冲液2.5?,ldNTP(each20mmol/L)0.5?,l引物27F和引5物1492R各0.5?,l补水至25.0?。lPCR反应循环参数:94?预变性5min,然后94?变性44s,57?退火60s,72?延伸2min,30个循环,最后72?保温5min。扩增产物于1.0%琼脂糖凝胶上进行电泳,对EB染色后的凝胶进行凝胶成像系统扫描后分析其扩增产物。为了得到较好的PCR结果,笔者对PCR反应成分包括Taq酶、BSA和Mg的用量等进行了不同的组合,以优化P/doc/d946ed53f01dc281e53af0a7.htmlCR反应条件。2?结果与分析2.1?土壤DNA的提取结果?以采集的土壤为材料,2种方法所得的土壤DNA的提取结果经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测,结果见图1。图1显示,所提总DNA的电泳条带较完整,拖带现象不是很明显,且DNA长度大于21kb,在提取过程中无明显降解和被剪切的现象。结合试验过程中的具体操作,使用玻璃珠、溶菌酶和SDS裂解法提取总DNA时,土壤的预处理比较简单,但所用时间比较长,在离心去除杂质过程中,经常会出现沉淀为棕黄色,所得DNA含杂质较多。采用CTAB、溶菌酶和冻融裂解法时,土壤的预处理所用时间也较长,但所得DNA含杂质相对较少。2.2?16SrDNA的PCR扩增结果?从图2可以看出,用这2种不同的方法所获得的DNA不经过处理直接用于PCR反应,即使额外地增加Mg或者同时增加Mg和BSA也无法扩增出16SrDNA。说明提取的DNA中可能含有污染物质腐2 殖酸,它鳌合了Mg或是和DNA或蛋白质发生结合,抑制了TaqDNA聚合酶的活性。而取1.02.0?l第1次PCR后的产物为模板进行PCR反应,结果显示,以CTAB、溶菌酶和冻融裂解法提取的DNA为模板经2次PCR以后与直接用细菌扩增的结果是一致的,而且提取的DNA不需经过纯化,2 只需进一步稀释和加入额外的Mg即可扩增出16SrDNA(图2泳道CD)。而以玻璃珠、溶菌酶和SDS裂解法提取的DNA经过同样的处理也无法扩增出16SrDNA(图2泳道2 2 2 ?注:泳道M为DNAMarker(?DNA/EcoRI HindIII);泳道AB为玻璃珠、溶菌酶和SDS裂解法提取的总DNA;泳道CD为CTAB、溶菌酶和冻融裂解法提取的总DNA。?Note:LaneM.DNAMarker(?DNA/EcoRI HindIII);LaneA-B.TotalDNAextractedbyglassbeads?lysozyme?SDSp/doc/d946ed53f01dc281e53af0a7.htmlyrolysismethod;LaneC-D.TotalDNAextractedbyCTAB?lysozyme?freezingthawpyrolysismethod.图1?总DNA的电泳图谱Fig.1?TheelectrophoretogramoftotalDNA?注:泳道M为DNAMarker(DL2000);泳道AB的PCR反应模板为大肠杆菌菌落;泳道CD为CTAB法的PCR结果;泳道EF为SDS法的PCR结果。?Note:LaneM.DL2000DNAMarker;LaneA-B.E.colicoloniesasDNAtemplateinPCR;LaneC-D.PCRamplificationre?sultsofDNAbyCTABmethod;LaneE-F.PCRamplificationresultsofDNAbyCTABmethod.图2?16SrDNA的PCR产物电泳图谱Fig.2?TheelectrophoretogramofPCRproductsof16SrDNA3?讨论从土壤中直接裂解微生物以获取总微生物DNA与从土壤中先分离微生物再提取DNA相比较,其优势明显在于微生物种类丢失较少;然而其不足之处在于这样得到的DNA往往含有较多影响后续研究如PCR反应的腐殖质等杂质。在进行PCR扩增时,DNA的量少至10-12pg就可以进行扩增,但只要有微量腐殖酸或其类似物存在就会抑制PCR扩3增,因此,去除腐殖质等是PCR反应的一个关键所在。该研究中,2种土壤DNA的提取方法所得总DNA质量在电泳图谱上并没有根本性区别,然而PCR的结果却完全不同。)38卷2期?吴红娟等?国内外芍药组织培养研究/doc/d946ed53f01dc281e53af0a7.html进展619报道。?体胚诱导率低,且畸形体胚多。(生根率低、生根质量不高。根从苗基部的愈伤组织产生,使根与茎中间形成离层,缺乏疏导组织的联系,影响下一步的移栽工作。)试管苗移栽不能成活,主要原因为:生根质量不高;移栽时期或者环境条件不适宜;组培苗生根后发生休眠。总之,由于上述原因,芍药的组织培养技术还未能在生产上推广和应用,相关难题还有待进一步研究。参考文献1234李嘉钰.中国牡丹与芍药M.北京:中国林业出版社,1999.秦魁杰.芍药M.北京:中国林业出版社,2004.郭风云.芍药组织培养技术的研究D.北京:北京林业大学,2001.TAKASHIH,MICHIKOA,TAKEHITOK.Invitropropagationofherba?ceouspeony(PaeonialactifloraPal.l)byalongitudinalshoot?splitmeth?odJ.PlantCellReports,1989(8):243-246.5于惠敏,路朋,何晓光.植物组织培养技术及常见问题和解决措施J.山东教育学院学报,2005(6):103.6张庆瑞,孙建洲,任凝辉,等.芍药组织培养技术研究J.河南农业科学,2006(4):88-90.7金飚,何小弟,吴建华,等.芍药离体培养初步研究J.江苏农业科学,2005(4):69.8赵明,张松荣,何小弟,等.芍药愈伤组织诱导及遗传转化技术的初步研究J.林业实用技术,2009(1):10-12.9兰海英.芍药的胚培养及芍药甙含量的研究D.呼和浩特:内蒙古大学,2003.10周美艳.芍药组织培养及遗传转化的初步研究D.扬州:扬州大学,2007.11胡秀婵,肖平.观赏兼药用/doc/d946ed53f01dc281e53af0a7.html花卉?芍药的组织培养J.农业工程技术:温室园艺,2007(8):32.12张庆瑞,杨秋生,李永华.不同植物生长调节物质对芍药离体培养的影响J.河南农业大学学报,2007,41(1):25-28.13胡映泉,冯海华,时宝凌.芍药不定芽的诱导技术J.山西林业科技,2003(S1):23-33.14董永义,宋旭,郭园.观赏芍药组织培养研究J.林业实用技术,2009(5):66.15张庆瑞.芍药组织培养技术的初步研究D.郑州:河南农业大学,2006.16LEEBK,KEJA,KIMYS.Studiesonthethidazurontreatmentofan?thercultureinP.albifloraJ.JournaloftheKoreanSocietyforHorti?culturalScience,1992,33(5):384-395.17TERESAO,AGNIESZKAM,DANUTAK.RegenerationofPaeoniamloksewitschiiLom.andP.tenuifoliaL.invitrofromdefferentexplantsJ.ActaSocietatisBotanicorumPoloniae,1998,67(3/4):223-227.18赵蓉,于晓南.芍药品种 桃花飞雪,愈伤组织以及芽的初步诱导C.中国观赏园艺研究进展2008?中国园艺学会观赏园艺专业委员会2008年学术年会论文集,2008:275-278.19仇道奎,张松荣,何小弟.芍药组织培养J.中国花卉园艺,2009(2):32-33.20GABRYSZEWSKAE.Theinfluenceofcytokinins,thidiazuron,pa?://doc/d946ed53f01dc281e53af0a7.htmlarclobutrazolandredlightonshootproliferationofherbaceouspaeonycv.JadwigainvitroJ.JournalofFruitandOrnamentalPlantResearch,1998,6(3/4):157-169.21KIMYS,LEEBK.Effectofplantgrowthregulatorsandculturetemper?atureonembryocultureofP.albifloraJ.JournaloftheKoreanSocietyforHorticulturalScience,1995,36(2):255-262.22KIMYS,LEEB.Somaticembryogenesisandplantregenerationincotyle?doncultureofP.albifloraJ.JournaloftheKoreanSocietyforHorticul?turalScience,1996,37(6):827-830.23BRUKHINVB,BATYGINATB.Embryocultureandsomaticembryo?genesisincultureofP.anomalaJ.Phytomorphology,1994,44(3/4):151-157.24李航,王永伟,何松林.牡丹试管苗生根研究进展和展望J.安徽农业科学,2007,35(12):3499-3499,3513.25储成才,李大卫.牡丹组织培养中玻璃化现象的出现及初步观察J.河南师范大学学报:自然科学版,1992,20(1):70-73.26王瑶,岳桦.芍药属植物组织培养中褐化问题的研究进展J.黑龙江农业科学,2009(2):159-160.27何松林,陈笑蕾,陈莉,等.牡丹叶柄离体培养中褐化防止的初步研究J/doc/d946ed53f01dc281e53af0a7.html.河南科学,2005,23(1):47-50.28郎玉涛,罗晓芳.牡丹愈伤组织的诱导及愈伤褐化抑制的研究J.河南林业科技,2007,27(1):4-6,29.29安佰义,赵飞.牡丹不同类型总酚含量与PPO活性研究J.北华大学学报:自然科学版,2005,6(2):169-172.64.30ZHANGW,GUOXD,WANGY,eta.lStudyontissuecultureandeffec?tivecloneestablishmentofHemisteptalyrataBungeJ.AgriculturalSci?ence&Technology,2009,10(1):47-50,104.31程麦风.大花蕙兰的组织培养和快速繁殖技术研究J.内蒙古农业科技,2005(Z2):190-191.32MENGDQ,YUANDB,ZHANGYF,eta.lReproductionofthethree-linegenicmalesterilelineparentMian7MB?1(BrasscianapusL.)andseedproductionofF1basedonsomatictissuecultureJ.AgriculturalScience&Technology,2009,10(1):22-25,114.33王二强,王占营,王晓晖,等.国内外牡丹组织培养技术研究现状J.内蒙古农业科技,2008(6):75-77.34ZHAOXJ,ZHANGHX.StudyontissuecultureandradiationmutationofAstragalusmembranaceusBge.var.mongholicus(Bge.)HsiaoJ.Ag?riculturalScience&Technology,2009,10(2):37-40.35李靖霞,朱国立,李晓娜,等.植物组织培http