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毒理学体外试验研究进展毒理学体外试验研究进展 摘要摘要: :随着医学、毒理学研究模式的转变，替代动物实验的体外模型研究成为毒 理学发展的重要方向之一。体外毒理学试验是指利用游离器官、培养的细胞或细 胞器、生物模拟系统以优化、减少或代替传统的动物实验,进行健康毒理学评价、 环境安全性评价和其它相关科学研究。 目前应用于毒理学替代的器官或组织主要 是胚胎干细胞、肝脏组织、肾脏及皮肤等。不少替代产品已实现商品化供应，一 些替代方法已通过有关机构的验证并被欧盟、美国等推广应用。它们都有着良好 的发展前景及应用价值。 关键词关键词:毒理学；体外实验；应用前景 Abstract:Along with medicine, toxicology research pattern transformation, one of substitution animal experimentation in vitro model study into toxicology development important directions.In vitro toxicology experiment is refers using the dissociation organ, the raise cell or the cell organ, the biology analogous system optimizes, the reduction or replaces traditional the animal experimentation, carries on the healthy toxicology appraisal, the environment security appraisal and other correlation scientific research.At present applies in the toxicology substitution organ or the organization mainly is the embryo stem cell, the liver organization, the kidney and the skin and so on.Many substitution product has realized the commercialized supply, some substitution method already through related promoted applications and so on organization confirmation and by European Union, US.They all have the good prospects for development and the application value. Key word: Toxicology; In vitro experiment; Application prospect 毒理学研究的传统方法是进行动物模型的体内试验，成本高、实验周期长，且较难从体 液中分离出足量、 高纯度的代谢产物进行生物化学和物理化学的研究。 而随着新技术的发展， 毒理学研究正逐步由体内动物研究向体外试验转变。 21世纪的毒性试验及其观念， 更多的是 伴随着现代技术和社会需求而发展。 现在，以减少、优化和替代为核心的3R 理论已愈来愈多的被国际社会所接受。体外 试验已成为国际社会法规管理和标准的要求。如今的体外试验已逐渐发展成为庞大的产业。 1,2 实验动物替代方法的研究在国外已有40多年的发展历史， 而在我国则是刚刚起步。 在我 国,也有不少高等院校、科研院所、安评和质检机构从事体外试验。体外毒理学评价实验室 的组织体外研究通常是在非临床安全评价的框架内,以获得人类健康或环境安全评估数据为 目的的试验。因此,体外毒理学实验室多是从事食品原料和添加剂、化学品、生物制品、甚 至农药、药品的体外试验。3 本文阐述了各类替代物的应用如胚胎干细胞在毒理学研究中的应用、 肝脏体外实验模型 在毒理学中的应用、 皮肤刺激动物实验替代物研究的现状与发展、 肾脏体外实验毒理学研究 等以及体外试验在毒理学试验方面的应用前景。 1 胚胎干细胞在毒理学研究中的应用 1.1 胚胎干细胞细胞的生物学特性 胚胎干细胞细胞是从哺乳动物早期胚胎分离、经体外培养并分离克隆出来的一种原始、 高度未分化细胞,具有能自我复制、更新,并在体外连续传代并保持未分化状态的性能。4可 用于药物或化学产品的效能和毒性检测。 由于胚胎干细胞细胞的体外分化体系可以模拟胚胎 发育过程中细胞与组织间复杂的相互作用,因此胚胎干细胞细胞可能成为毒理学研究的有效 工具。 1.2 胚胎干细胞的体外培养 近年来,经过广泛的应用和研究,欧洲替代方法研究中心推荐了有效性较高的3个体外发 育毒性筛选实验,即体外全胚胎培养试验(whole embryo culture ,WEC)、胚胎细胞微团培养试 验(micromass culture ,MM)和胚胎干细胞试验(embryonic stem cell test ,EST)作为体外筛选的 首选方法。除了作为体外筛选试验外,上述方法还可应用于发育毒性发生机制的研究,通过与 整体动物试验相结合,提供有价值的毒性作用资料,并间接减少了所用动物的数量。5 1.3 胚胎干细胞在毒理学中的应用 胚胎干细胞细胞实验主要应用领域是环境污染物、 研发药品及农药等化学制剂对人体以 及动物胚胎致畸性、细胞毒性等潜在损伤的研究,作为人及哺乳动物发育毒性的体外代替方 法6。 胚胎干细胞细胞能发展为胚体后的生物系统,可模拟体内细胞与组织间复杂的相互作用, 这在毒性研究领域中具有广泛的用途。与体内毒性实验相比,具有更高的灵敏性和准确性,并 间接减少了所用实验动物的数量7。 除了能评估毒性之外,通过受试物对胚胎干细胞细胞的早 期的胚胎阶段到最终分化成特定细胞的全过程的检测,可以对受试物是否具有胚胎毒性做出 正确的判断，提高预测的准确度8。 利用胚胎干细胞进行毒理学体外实验主要有2种方法:一是利用干细胞迅速生长的特性, 用以观察受试物对正在分裂细胞的毒性作用； 二是利用胚胎干细胞细胞在体外一定条件下诱 导分化成特殊的细胞,用以研究受试物的特殊毒性作用。与不同时间获取的原代细胞相比， 干细胞模型的毒性检测结果更具有可比性,数据更可靠。胚胎干细胞细胞为基础的预测毒性 检测方法虽不会完全取代在整个动物及人体上的实验,但会使毒性的预测更为精确。 1.4 目前胚胎干细胞仍存在的不足及展望 由于技术和条件的限制,胚胎干细胞细胞在体外培养的条件从理论上讲还不可能与体内 胚胎中的多能细胞的生长条件完全相一致，所以在受试物的作用下,对于干细胞发育的干扰 因素及机制的判断与体内结果将出现差异,影响到体外结论向体内的推断,降低了实验结果的 可靠性9。 目前,胚胎干细胞细胞体外分化为特定类型细胞大多采用诱导剂诱导的方法，但是诱导 剂本身可能具有毒性作用，同时诱导剂和诱导方法的使用也因人而异,这对于正确判定受试 物可能作用的靶器官,以及对敏感组织细胞产生细胞毒性和抑制分化能力的检测产生偏差,因 此如何达到分化细胞特异性与检测结果准确性的平衡,仍需要进一步研究。10 2 肝脏体外实验模型在毒理学中的应用 传统的体内试验在研究外源性化合物致肝损伤时存在一些不足之处11，体外试验在一 定程度上弥补了体内试验的缺陷：肝脏毒理学研究中常用的体外试验模型有离体肝脏灌流、 肝组织切片和离体肝细胞(肝细胞悬液和原代培养肝细胞)等：离体肝脏灌流最接近体内状 态，可用于评价肝脏生理学和形态学改变；肝组织切片保存了肝脏的组织结构，可将细胞毒 性检测和组织形态学结合评价肝损伤情况； 离体肝细胞则从细胞水平评价化合物代谢和细胞 毒性。 2.1 肝脏体外试验模型 肝脏毒理学研究中较常用的体外试验模型有： 离体肝脏灌流； 精确切取的肝组织 切片； 分离的肝细胞，包括肝细胞悬液和原代培养肝细胞； 肝细胞系；遗传工程细 胞：此5种试验模型各有优缺点，在进行毒理学试验时应根据试验条件和试验目的正确选择 体外试验模型。12 2.1.1 离体灌流方法， 被广泛应用于外源性化学物代谢和肝毒性研究。 和其他体外模型 相比， 离体肝脏灌流最接近体内状态， 其最大的优势在于保持了肝组织结构和功能的完整性， 可进行短期的代谢动力学试验，但相对其他体外模型而言并没有减少使用的动物数。13 2.1.2 肝组织切片与离体肝脏灌流一样， 保存了肝脏的组织结构， 包含肝组织内所有类 型细胞，还保存了完好的细胞基质和细胞间相互作用，其操作较离体肝脏灌流简单14。与 其他体外试验模型相比，肝切片功能异质性和代谢能力比较接近整体器官。肝组织切片，大 大减少了使用的动物数15。也可以用人肝切片进行试验，避免了结果由动物向人外推的过 程。 由于多种动物包括人肝均可制成肝切片进行试验， 此种试验模型还可用于种属间比较研 究， 如有报道用豚鼠肝切片和大鼠肝切片研究对乙酰氨基酚的毒性， 发现大鼠肝切片将对乙 酰氨基酚代谢为无毒的产物高于毒性产物， 豚鼠肝切片GSH耗竭的量效关系比大鼠肝切片明 显，生成的毒性产物量也明显高于大鼠肝切片肝切片16。不足之处是胆管系统被破坏，无 法收集胆汁进行分析17，另外由于切片存在一定厚度，切片表面肝细胞与内部肝细胞接触 的受试物浓度有一定差异。 新鲜的肝切片存活时间相对较短， 且肝细胞存活率和功能随试验 条件不同而有差异。 2.1.3 成年大鼠肝细胞分离方法始建于2O世纪60年代，7O年代由Seglen等人进行改进 和简化，即如今广泛采用的胶原酶两步灌流法18。在胶原酶灌流液中加人胰蛋白酶抑制剂 还可分离出肝细胞对，经离心处理能获得纯度为85的肝细胞对。与离体肝脏灌流相比，肝 细胞悬液和肝细胞原代培养均不要求特殊的装置， 且能更好地控制营养和激素水平、 氧供以 及染毒的时间和浓度等试验条件；可摒除血流、细胞类型异质性、神经、体液因素的影响； 一个肝脏分离的肝细胞可以制成几十种不同条件的肝细胞悬液或进行不同条件的细胞培养， 大大节约了动物数， 并可以同时对多种化学物进行量效关系和时效关系研究； 细胞存活情况 在整个实验过程中易于检测， 可对单个细胞进行形态学观察。 不足之处在于失去肝小叶结构 以及细胞原有的做环境， 胆管系统也不存在， 因此不能测定肝细胞中代谢产物进入血液或胆 汁的排泄情况肝细胞悬液存活时间短，仅(24)h，且细胞功能与培养液的组成密切相关， 原代培养肝细胞在一定程度上弥补了这个缺陷19。研究表明将肝细胞与各种凝胶基质进行 三明治培养或与其他相关细胞进行共培养可以延长肝细胞的存活时间及保持肝细胞功能， 扩大了离体肝细胞的应用范围20。目前人工肝细胞培养也有显著进展，在细胞移植、人工 肝脏和研究肝脏特定功能尤其是细胞色素P450的表达方面有广泛应用。 2.1.4 肝细胞系来源于肝脏肿瘤或转染病毒和细胞DNA的正常肝细胞，其主要特点是 细胞数量不受限制。亚细胞组分如经超速离心制备的肝细胞膜、线粒体、细胞核、微粒体等 也用于研究外源性化合物致肝损伤， 但仅适用于短期研究。 遗传工程细胞可用于研究外源性 化学物的代谢过程。遗传工程细胞来源广泛，花费较低，且细胞数量不受限制，在研究参与 化学物代谢、共价结合、药物抑制的酶有一定作用。18 2.1.5 体外试验模型在毒理学研究中也存在一些不足， 如毒性反应从体外向体内外推的 问题，体外毒性试验难以预测慢性毒性等。上述几种体外试验模型各有优点和局限性，应根 据研究目的和具体条件选择适当的方法，结果评定时要充分考虑方法本身的特点和局限性， 并与体内试验结果结合进行。 需要解决的问题是如何进一步提高各种体外试验模型的存活时 间， 正确认识并建立各模型间的相互联系近年来， 形态学和分子生物学研究手段如免疫组化、 RTPCR、Northern blotting、mRNA原位杂交等方法相继与体外试验模型结合，大大扩大了 体外试验模型的应用。21 2.2 肝脏体外试验模型毒性研究 肝脏体外试验模型毒性研究范围主要是肝脏毒性， 致癌致突变和药物代谢等方面。 如中 国仓鼠细胞V79、CHO、CHL和人B淋巴母细胞系，可在cDNA表达的同时进行体外毒理 学评价；慢性嗜酒者体内CYP2E水平较高，服用对乙酰氨基酚后可能发生急性中毒。有利 于进行药物代谢活性或毒性研究，还有助于预测药物相互作用，指导临床个体化用药。最大 优点是可用人类来源的体外实验模型， 消除实验动物和人类之间的种属差距。 随着体外试验 模型的不断完善，它必将会为体内毒性检测实验设计提供可靠的参考数据。22 2.3 应用前景 肝脏体外模型可根据体外试验结果指导体内实验的设计，进一步完善体外试验系 统，使其能更准确地模拟人类的生理及其它功能，预测药物的毒副作用。为先导化合物的临 床前药物代谢研究提供可靠的参考数据，有助于选择合适的实验动物，进一步完善cDNA稳 定性表达系统和in silico ADMEfrox模型，提高外源性化合物毒性检测的灵敏度，最大限度 地减少化合物漏检，缩短新药研发周期。21 3 体外实验在肾脏毒理研究中的应用23 肾脏是药物在体外代谢与排泄的主要器官,它的高血流率和浓缩功能使其对血液中的毒 物极其敏感而易受到损害。尽管许多关于肾脏毒理的研究已广泛开展,并得出了一定的结论, 但是由于肾脏组织结构极其复杂,传统的实验方法在细胞和分子水平的毒性机制探讨受到限 制。而体外实验方法的发展,促进了这些方面的精确研究。体外试验具有简便、快捷、经济 及可直接利用人体细胞等优点,与整体试验一起用于毒理学的研究。肾脏体外实验主要方法 如下。 3.1 肾脏体外实验主要方法 3.1.1 肾灌流是研究外源化合物肾毒性的较好的体外实验方法,它保留了脉管系统的完 整性,提供了一个与完整动物相似的环境,而且它不受高级调节系统和其他器官组织的影响, 专一的研究肾脏对受试物的反应,更重要的是可以精确控制受试物的浓度,所以在肾毒性的研 究中得到广泛应用。 但是离体肾脏的功能只能维持很短的时间， 即使是在严格的无菌操作和 补充氧含量的情况下，其寿命也只能相对延长。 3.1.2 游离肾单位或肾单位段灌流技术是研究上皮转运的理想系统,它能够传递许多有 价值的肾功能特征的信息, 用于肾小管段或细胞水平的生理机制和毒理研究。 该方法优点是 不受受试物浓度限制,可以人为决定受试浓度,而且各段小管的分泌功能也可测定,使得转运 过程更清晰。缺点是操作很复杂,较少作为常规试验。 3.1.3 肾组织切片技术是一个体外试验中运用最早且仍广泛使用的技术之一,许多现代 肾毒性机制的基础知识都是在此实验中得出的。此系统的优点是保持了细胞间的结构,并且 去除了血流动力学的影响,主要用于研究毒物对肾脏代谢和转运的影响。但是,肾切片技术存 在的几个不足限制了其在精确研究中的应用:肾切片中包含不同的细胞型,要评价某一特定细 胞型暴露于化合物的功能改变就很难进行；切片仍有一定厚度,许多相互作用的细胞堆积在 一起,无法保证每一个目的细胞都暴露于相同的氧和营养液浓度。但它只是一个化合物肾毒 性的初筛实验方法。 3.1.4 新鲜分离的肾小球,肾小管及其细胞等都已被用于化合物的急性效应的评价。制 备出的小球或小管可以用于不特异但敏感的毒性试验,而不同部位的细胞则可以用于特异性 实验。此方法的优点是上皮结构的完整性得以保持,而且外源化合物损伤引起的肾单位段特 异性的生化改变容易检测,有利于肾毒性机制的更好解释。不同部位的游离肾细胞也越来越 多地用于药物代谢、膜转运、毒性机制等的研究。但是由于游离的肾单位、细胞在孵育液中 只能存活几个小时,无法进行更长期的实验。 3.2 应用前景 越来越多的新技术不断地促进着体外实验技术的发展，研究发现在培养液持续灌注下, 生长于微孔支持物上的细胞常表现出良好的分化状态。而且,不断地灌流使离体细胞能够在 近似活体组织条件下生长增殖,有助于传代细胞一些丢失的功能再表达。共培养技术通过将 肾脏上皮细胞与内皮或免疫细胞一起培养,进而进行一些重要的信号分子相互作用的研究 (如细胞素),并促进了这些分子在临床治疗中的应用和大批量生产。 而且细胞培养技术很好的 解决了种属差异性的问题,来源于人的肾脏细胞或细胞系会更多地用于研究领域,其中最主要 的两个应用方面是:合成新药的安全性评价和环境污染物可疑肾毒性的研究与防护。最近有 研究者对组织培养进行了改良,提出了器官组织的持续灌流培养法。生物技术、细胞融合技 术也将更多地运用于解决细胞培养中存在的问题。 4 皮肤组织替代物研究 与大规模的动物实验相比， 人工皮肤替代模型大大降低了检测费用， 顺应了替代医学发 展的潮流。其特异性、敏感性、精确性均较高，与动物实验的等同性较一致。人工皮肤组织 形态的改变及基因表达的变化也是观察指标，多点的毒性评价体系不仅直观、快速，而且可 根据受试物的特性调整评价指标。 4.1 皮肤刺激动物实验替代方法 4.1.1 体外细胞培养 皮肤是外源性化学物首先作用的主要器官之一。人类皮 肤由表皮，真皮和深层的皮下组织组成。人类表皮主要由角朊细胞组成，由于它在表皮免疫 监控中亦起着关键作用， 所以角朊细胞成为科学家研究动物实验替代方法首选的细胞系。 24 现在细胞培养多采用人角朊细胞， 以避免不同种属之间结果外推的不确定性。 人角朊细胞主 要来自于人包皮切除手术和美容外科手术， 来源有限， 且供体间的差异可导致细胞间反应的 不同， 原代培养的角朊细胞对刺激物的敏感性会随着传代代数的增加而改变， 不利于研究的 连续性。所以，有研究选择使用一种非致癌性的、白发性永生化的人角朊细胞系HaCaT细胞 25作为模型细胞系统来体外评价化合物皮肤刺激性 。HaCaT细胞是由正常人腹部表皮衍生 而来的一种角朊细胞系， 在浸没培养时即具有同正常人角朊细胞相似的分化特性， 而且培养、 传代十分方便，几乎能无限性提供同一细胞，从而解决皮肤细胞的来源问题，同时也可提高 模型的重现性，因而备受科学家的关注。 4.1.2 皮肤成纤维细胞培养 成纤维细胞是皮肤中另一种重要的细胞， 主要存在于真 皮组织中。研究表明，真皮中的成纤维细胞能分泌多种细胞因子和细胞外基质，调节细胞生 长、增殖、分化和迁移等功能，维持皮肤的形态与特性，调节皮肤的生理功能。研究证明人 成纤维细胞培养可用于预测人类皮肤刺激物，而且具有相当高的敏感性。但研究也表明，由 于形态学和生理学上的差异，角朊细胞系要比成纤维细胞系更适用于构建体外替代模型 26,27。 体外细胞培养模型制作以及实验操作相对简单、方法重现性好、冷冻保存相对容易，然 而，单层细胞培养存在着不少的缺陷，最重要的是模型缺乏完整皮肤的一些重要的特征，如 表皮细胞排列紧密、 表皮选择性渗透屏障以及皮肤不同细胞类型之间的相互作用， 不能模拟 正常人的皮肤。而且，因为缺乏角质层的屏障作用，化学物对细胞产生直接的细胞毒性，使 细胞模型呈现高敏感性， 所以， 单层细胞实验所获得的结果一般难以用来解释体内情况或与 体内情况相联系。28 4.1.3 皮肤组织培养 科学家从正常人或动物身上获取完整的皮肤组织块， 因为组织 块具有正常的结构和所有的细胞成分， 因而能很好地模拟真实的体内情况。 它可以模拟现实 皮肤解剖结构，又可以直接局部应用受试物，且不受受试物性状的限制，与真实暴露情况一 致， 可广泛应用于检测各种不同的化学物。 离体皮肤组织培养能很好地模拟人体实际接触外 源性化学物的情况，是一种很有使用价值的动物实验的替代方法。但是，研究发现皮肤组织 培养仅适用于短期染毒，因为组织体外存活的时间很短。29同时，伴随着各种蛋白质分化 标志物的表达和表皮脂质成分的修饰， 以及角质层屏障功能损伤， 极大地影响模型的预测能 力，从而限制模型的广泛应用。 4.1.4 重组人皮肤替代物 皮肤组织培养虽然模拟现实能力强， 但鉴于其皮肤来源有 限、伦理学限制以及存活时间短等不利因素，难以广泛应用。与此同时，随着组织工程学的 出现与发展，使体外重构有活性皮肤替代物成为现实。至今，已建立的重组皮肤替代物有很 多种， 主要有表皮替代物和全层皮肤替代物两种， 将多层分化人角朊细胞培养在含人成纤维 细胞基质上。研究表明，重组人皮肤模型具有天然组织所具有的所有的主要的特征。30张 兆清等将人成纤维细胞与小牛工型胶原混合培养， 制成真皮基质， 然后在其表面接种人角朊 细胞，置于气、液交界面进行培养，从而构建检测用组织工程皮肤模型31。 重组人皮肤模型是现在最具有发展前景的动物实验替代方法， 它不仅能最大程度地模拟 现实人体暴露情况， 减少甚至避免使用人体组织或动物实验， 而且能改变并精确控制实验条 件， 以提高重组皮肤的生存质量和满足实验的各种需求， 有利于外源性化学物皮肤相关性损 伤基本机制的研究、安全性评价和危害鉴定的广泛开展以及实验方法的统一标准化。然而， 与正常人皮肤比较，皮肤替代物表皮屏障功能有所缺陷。在正常皮肤中，尚存在着血管内皮 细胞、炎症细胞以及神经组织，这些组成成分相互作用对皮肤症状的产生是必需的。所以科 学家不得不采用更加复杂的参数并且多种指标相结合的方式去评价受试物的刺激性 。 4.2 应用评价 由于方法简单快速、检测成本低廉，单层细胞的替代模型在毒性检验，尤其在原料的初 筛中起到了重要的作用。但其结构和功能单一、评价指标过于简单，固体或脂类物质也不适 用于细胞培养系统， 使其应用受到一定限制。 如何拓展其应用范围和开发新兴的检测用细胞 是细胞替代方法的发展方向。 与大规模的动物实验相比， 人工皮肤替代模型大大降低了检测 费用，顺应了替代医学发展的潮流。人工表皮还不是真正意义上的人工皮肤，即使是器官型 人工皮肤， 组织结构上还存在不少缺陷有待改进。 人工皮肤替代模型主要针对急性和亚急性 毒性试验设计，但其价格昂贵，引进和推广受到一定程度限制。 5结论 近几年来,随着体外试验的理论和技术的发展,给预测毒理学研究提供了新的思维和研究 工具。此外,胚胎干细胞用于预期毒性模型必须在科学可行,政策许可的范围。体外试验是通 过在体外维持某一个靶器官或靶细胞,甚至靶分子的正常生理功能,观察受试物对其产生的作 用,从而提供毒理学资料的方法,它具有简便、快捷、经济及可直接利用人体细胞等优点,与整 体试验一起用于毒理学的研究。 在毒理学中以体外毒性试验系统作为实验动物的替代系统日渐广泛。其中,利用分离的 细胞作为毒性试验是毒理学中使用最广泛和最深入的体外实验系统。因为,利用细胞可更严 格控制实验条件,排除可能的混淆因素如神经系统、 免疫系统的影响,并能直接控制胞外基质、 化学物浓度及接触时间,有效地研究毒性作用的生化机理。体外试验模型在毒理学研究中也 存在一些不足，如毒性反应从体外向体内外推的问题，体外毒性试验难以预测慢性毒性等。 体外模型不能完全代替动物模型的体内实验， 在进行外源性物质代谢或毒性研究时， 应全面 考虑体外、体内试验的优缺点，权衡利弊进行实验设计。总之,体外实验方法将会广泛地运 用于科学研究中,弥补整体实验的不足,与之一起为人类的健康服务。 参考文献参考文献 1罗宾,库珀,罗伯特.S.卡普兰. 成本管理系统设计教程与案例 M .北京:东北财经大学出 版社,2003. 2欧阳清,杨雄胜.成本会计学 M.北京:首都经济贸易大学出版社,2004. 3程树军，邹志飞，黄韧化妆品毒性检验壁垒性替代技术的研究进展中国比较医学 杂志，2006，16：379381 4SpivakovM,Fisher AG. 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