浅析中药清除羟自由基实验的改良

1 / 5 浅析中药清除羟自由基实验的改良 摘要：目的对邻二氮菲 -Fe2+氧化法进行改良，使其在用于自由基清除剂筛选时更为有效和更为敏感。方法在不同的 pH 环境、不同的保温时间及不同的测定波长条件下进行对比实验。结果邻二氮菲 -Fe2+络合物在 pH 4.5 的环境下及510 nm 的测定波长时有较大的吸光度， 30 min 的保温时间使各管有较大并较为稳定的吸光度。结论通过对邻二氮菲 - Fe2+氧化法的实验改良能提高该方法筛选自由基清除剂的灵敏度。 关键词： 自由基清除剂； 邻二氮菲； 羟自由基 机体在代谢过 程中产生多种自由基，包括超氧阴离子自由基（ O-2 ）、羟自由基（ OH ）及其活性衍生物 H2O2等，其中以 OH 化学性质最活泼。一定数量的氧自由基可为机体所用，但过多的氧自由基将作用于体内蛋白质、核酸、脂类等生物分子，造成细胞结构和功能受损，进而导致体内代谢紊乱引起疾病 1 4。因此，自由基清除剂的合成及寻找成为当前医药研究的主要方向之一，而中药的天然、丰富及低毒更受人们的青睐。目前人们测定自由基清除剂清除羟自由基的方法有很多，其中邻二氮菲 - Fe2+氧化法操作简单，设备要求不高，易于推广和应用。本实验对该 方法进行了若干改良。 2 / 5 1 材料与方法 1.1 试剂维生素 C（郑州羚锐制药有限公司生产）、邻二氮菲（天津市科密欧化学试剂有限公司生产，分析纯）、硫酸亚铁铵（广东光华化学厂有限公司生产，分析纯）、过氧化氢（广东汕头市西陇化工厂生产，分析纯）、磷酸二氢钾（上海市国药集团化学试剂有限公司）、无水乙醇和氢氧化钠（湖南汇虹试剂有限公司生产，分析纯）。 1.2 仪器 752N 紫外可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司生产）， DK-600S 三用恒温水浴箱（上海精密实验设备有限公司生产）。 1.3 方 法以维生素 C 作为自由基清除剂，用邻二氮菲-Fe2+氧化法检测 H2O2/Fe2+体系通过 Fenton 反应产生的 OH 。 H2O2/Fe2+体系产生的 OH 将邻二氮菲 -Fe2+氧化为邻二氮菲 -Fe3+，使邻二氮菲 -Fe2+对 536 nm 波长的最大吸收减弱， A536 明显降低。当反应体系中存在 OH 清除剂时，此氧化过程受抑制， A536 则降低不明显，并可通过 A536 值比较 OH 清除剂的清除能力 5。对该实验进行三个方面的改良：一是将反应环境由 pH 7.4 改为 pH 4.5 的酸性环境；二是将 37 保温时间由 60 min 改 为 30 min；三是测定吸光度的波长由 536 nm 改为 510 nm。实验过程中分别在 pH 7.4的磷酸缓冲液及 pH 4.5 乙酸 -乙酸钠缓冲液的环境下进行对照实验；在保温 5 60 min 的时间范围内、 536 nm 和 510 nm3 / 5 波长分别测定吸光度，比较两种 pH 条件下吸光度的差异。反应中依次加入邻二氮菲、缓冲液、自由基清除剂维生素 C、Fe2+及 H2O2 为加药管；不加维生素 C 为氧化管；不加维生素 C 及 H2O2 为对照管。 1.4 统计学处理组间采用 t 检验，数据以 s 表示。 2 结果 2.1 不同测 定波长及不同 pH 环境下的比较从表 1 可以看出，邻二氮菲 -Fe2+络合物的最大吸收波长为 510 nm，而最佳酸碱环境为 pH 4.5。表 1 不同测定波长及不同 pH 环境下的比较 (略） 2.2 不同保温时间及不同 pH 环境下的比较图 1 显示了 pH 7.4 时不同保温时间对 A510 的影响，对照管吸光度于15 min 时达高峰，随后缓慢下降；而加药管和氧化管吸光度一开始便呈现急剧下降的趋势。图 2 显示了 pH 4.5 时不同保温时间对 A510 的影响，对照管吸光度于 30 min 时达高峰，此后处于基本稳定状态；加药管和氧化管吸光度均于 30 min后才出现较明显的下降。 2.3 各管之间吸光度的变化值（ A ）比较从表 2 可以看出，随着保温时间的延长，各管之间的 A 逐渐加大，但 pH 4.5 时的 A 加药管 -氧化管，在 30 min 时最大，此4 / 5 后较为稳定。表 2 各管之间吸光度的变化值（ A ）比较（略） 3 讨论 实验表明，邻二氮菲 -Fe2+络合物在酸性条件下（ pH 4.5）比较稳定，有较高的吸光度，并且最大吸收波长为 510nm。而保温时间也是实验中的一个重要环节，保温到某一时间时， 各管的吸光度较大，同时各管之间的吸光度变化值（ A ）也较大，有利于自由基清除剂的甑选。从实验中观察到，在pH 4.5 的条件下，对照管保温到 30 min 有最大的吸收峰，加药管也有较大的吸光度，使加药管与氧化管之间 A （ A加药管 -氧化管）达到最大，该值更能说明自由基清除剂的作用强弱，是判断自由基清除剂的重要指标，并且还能反映该方法的灵敏度。而在 pH 7.4 时，加药管和氧化管一开始便呈现急剧下降的趋势，虽然两管吸光度有所差异，但 A加药管 -氧化管较 pH 4.5 时要小得多，不具有说服力，也降低了反应的灵敏度。综上 所述，采用邻二氮菲 - Fe2+氧化法衡量自由基清除剂的作用时，最佳反应条件为 pH 4.5，测定波长为 510 nm， 37 保温时间为 30 min。 【参考文献】 1 Limoli CL,Kaplan MI.Attenuation of radiation-induced genomic instability by free radical scavengers and cellular proliferation J .Free Radic.Biol.Med.2001,31(1):10. 5 / 5 2 Valko M, Izakovic M. Role of oxygen radicals in DNA damage and cancer incidence J . Mol Cell Biochem. XX,266(1-2):37. 3 Yamamoto H,Watanabe T.In vivo evidence for accelerated generation of hydroxyl radicals in liver of long-evans cinnamon (LEC) rats with acute hepatitis J . Free Radic.Biol.Med.2001,30(5):54