研究颜面赝复体粘接剂的体外细胞毒性

1 / 8 研究颜面赝复体粘接剂的体外细胞毒性 【摘要】 目的： 利用体外细胞培养技术 , 对有机硅改性聚丙烯酸酯类颜面赝复体粘接剂 1（ FPSA 1）的细胞毒性进行评价 . 方法： 采用 MTT法评价 FPSA 1的细胞毒性 . 利用体外培养的小鼠肺成纤维细胞 (L 929),在培养液中分别添加 500， 750 mL/L FPSA 1 浸提液 ,于加样后 2， 4， 7 d用 MTT 法显色 , 用多道扫描酶标仪测 A490 nm 值 ,计算相对增殖率 ,对 FPSA 1 的细胞毒性进行评价 . 结果： 随着时间推移 ,不同浓度的 FPSA 1 浸提液对 L 929细胞增殖均无明显作用 (P0.05), 各浓度 FPSA 1 浸提液加样后 2， 4，7 d之间差异无统计学意义 (P0.05),提示 L 929细胞增殖与浸提液浓度无明显相关性 ,FPSA 1 的细胞毒性分级为 1级 . 结论 : FPSA 1无明显细胞毒性 , 具有良好细胞相容性 , 是一种有发展前景的颜面赝复体粘接材料 . 【关键词】 颜面部缺损；赝复体粘接剂；细胞毒性； MTT法 0引言 颜面赝复体的固位中组织倒凹和机械固位多用作辅助方式 ,种植体固位虽然是颜面赝复体首选的固位方式 1 ,但由于多种原因使患者不 能接受种植手术时 , 就需依赖粘接固位 . 传统的赝复体粘接剂中 ,聚丙烯酸酯类粘接剂价廉 ,2 / 8 粘接强度尚可 ,但皮肤上的粘接剂残留较难去除 2；有机硅类粘接剂粘接强度高 ,皮肤残留少 ,但含有机溶剂具有潜在刺激性 3 . 我们通过乳液聚合的方法合成有机硅改性聚丙烯酸酯类的颜面赝复体粘接剂 1（ facial prosthesisskin adhesive 1,FPSA 1） ,并参照国际标准化组织发布的医疗器械生物学评价标准 ,进行体外细胞毒性试验 4 ,将小鼠肺成纤维细胞 (L 929)在离体状态下进行培养 ,以探讨 FPSA 1 浸提液对 L 929细胞生物学活性的影响 ,评价其生物的相容性 . 1材料和方法 1.1 材料 FPSA 1 (第四军医大学口腔医学院与西北工业大学联合研制 )；无菌滤纸 , 高压蒸汽灭菌后备用 . L929 细胞株（第四军医大学基础部免疫学教研室）； DMEM 培养液 (美国 Gibco公司 )；含 100 mL/L 的标准胎牛血清 (FBS,杭州四季青公司 )； 100 kU/L氨苄青霉素、 100 kU/L 硫酸链霉素 , pH=7.2 7.4；胰蛋白酶 ,四甲基偶氮唑盐 (MTT) (美国 Sigma 公司 )；四甲基偶氮唑盐溶液 ,实 验前用磷酸盐缓冲液 (PBS)新鲜配制 , 浓度为 5 g/L,过滤除菌后 4避光保存 ,1 wk内使用 . 二甲基亚砜 (DMSO, 北京索莱宝公司 )； 倒置相差显微镜 (日本 OLYMPUS TH4 200)；超净工作台 (AIR TECH,苏净集团安泰公司 )； CO2 培养箱 (HERA cell 150, Germany)； 25 cm2 细胞培养瓶 ,96孔细胞培养板 (NUNC,丹麦 ). 3 / 8 1.2 方法 1.2.1 浸提液制备将无菌滤纸裁成 1 cm 1 cm 试样备用 , 按每面涂 50 L 的粘接剂使滤纸浸渍均匀 ,清洁空气轻 吹2 3 min,待粘接剂由白色乳液变至无色透明胶膜 ,依照 ISO 10993 12样品制备要求 5 ,试样按表面积与浸提介质比6 cm2/mL 加入含 100 mL/L FBS 的 DMEM 培养液中 ,另将未涂粘接剂的无菌滤纸作为阴性对照按同样比例浸于相同培养液 ,放置在 37， 50 mL/L CO2培养箱内浸提 72 h,分别得到1000 mL/L FPSA 1 浸提液和阴性对照组浸提液 ,过滤除菌 . 再将 1000 mL/L 浸提液经 DMEM培养液稀释成 500， 750 mL/L浓度浸提液备用 . 1.2.2 细胞培养将对数 生长期的 L 929 细胞经 2.5 mL/L胰酶消化、吹打分散后计数 ,用含 100 mL/L FBS 的 DMEM培养液配成浓度为 1 107/L的细胞悬液 ,按每孔 100 L的细胞悬液接种于 96孔培养板上 ,放入 37， 50 mL/L CO2 培养箱中 . 四周边缘孔不接种细胞 ,每孔加入 100 L 的 DMEM培养液 ,起边缘封闭作用 . 1.2.3MTT 测试细胞培养 24 h 后弃去原培养液 ,用 PBS洗涤 2 次 ,进行培养液交换 ,按每孔 200 L 分别加入 500，750 mL/L 的 FPSA 1 浸提液 ,另设阴性和阳性对照组 ,分别加 入等量无菌滤纸浸提液和含 6.4 mL/L苯酚的培养液 ,每组4 / 8 重复 6孔 ,常规培养 ,每日在倒置显微镜下观察细胞形态及增殖情况 . 分别于加样后 2， 4， 7 d 取出 96孔板 ,在受试孔中每孔加入 20 L 的 MTT 溶液 ,37， 50 mL/L CO2 培养箱中保温 4 h后弃去旧液 ,每孔加入 150 L的 DMSO,振荡 10 min,在多道扫描酶标仪上测 A490 nm 值 ,计算细胞的相对增殖率(RGR). RGR(%)=(实验组 A490 nm/阴性对照组 A490 nm)100%,细胞毒性分级按如下标准 6评价 : RGR 100 为 0级 ;80 99为 1级 ;50 79为 2级 ;30 49为 3级 ;0 29为 4级 . 统计学处理：用 SPSS12.0统计分析软件 ,对数据采用方差分析和 Tukey 多重比较检验 ( =0.05). 2结果 2.1MTT 测定加样后 2， 4， 7 d,阳性对照组与其余各组的 A值之间均有显著性差异 (P0.05，表 1)；在各时相 500 mL/L 和 750 mL/L FPSA 1 浸提液组的 RGR 均大于 80%,参照标准评分 FPSA 1 的细胞毒性为 1 级 ,各组细胞 RGR及毒性评级结果见表 2. 表 1FPSA 1 与对照组的 A490 nm值（略） bP 提液检测其细胞毒性 ,对受试材料溶出物的毒性检测敏感性较高 ,也比较符合动物体内的毒性实验结果 ,是一种较好的体外评价生物材料细胞毒性的研究方法 8 . L 929细胞具有传代稳定、繁殖迅速、体外培养条件低、能为许多材5 / 8 料细胞毒性所共用等优点 ,成为细胞毒性试验中应用最早且使用最广泛的细胞 . A: 阴性对照组； B： 50 mL/L FPSA 1 浸提液组； C： 750 mL/L FPSA 1 浸提液组 ; D: 阳性对照组 . 图 1倒置显微镜观察加样后 7 d 各组 L 929 细 胞形态学变化 100（略） 我们采用 500 mL/L 和 750 mL/L FPSA 1 浸提液进行 MTT实验 ,以检测细胞毒性是否与材料溶出物有关 ,以及溶出物浓度与细胞毒性的剂量依赖关系 ,可以比较全面地评价FPSA 1 的细胞毒性 . 经 500 mL/L 和 750 mL/L FPSA 1浸提液培养的 L 929细胞 ,在加样 2， 4 和 7 d后 ,细胞 RGR均在 80%以上 ,细胞毒性为 1 级 ,各浓度浸提液组之间 RGR 无显著差异 ,提示 L 929细胞增殖与 FPSA 1 浸提液的浓度无明显相关，符合生物材料的医用标准 . 与阴性对照组相比 ,750 mL/L FPSA 1 浸提液组局部出现少量细胞溶解或坏死，这可能是由于在细胞毒性试验中 ,通常随着浸提液浓度的增加 ,细胞毒性也会相应增加的缘故 9 . FPSA 1 为有机硅改性的聚丙烯酸酯类粘接剂 ,是用含双键的有机硅单体与丙烯酸酯单体 ,通过自由基引发的乳液聚合反应合成的 . 在聚合反应过程中加入了离子型和非离子型的乳化剂 ,其中离子型乳化剂在制备粘接剂浸提液时可促进胶膜吸水溶解 ,使得粘接剂胶膜中残留的丙烯酸酯单6 / 8 体或其它助剂析出 ,从而表现出轻微的细胞毒性 . 我们的结果提示在粘接剂合成过程中应尽量提 高共聚单体功能团的交联程度即提高单体转化率 ,或采取相应措施以减少粘接剂中的单体残留，同时还应提高颜面赝复体粘接剂的耐水性能 . 这一方面可通过提高聚合物中有机硅的含量来实现 ,另一方面可以在乳液聚合反应中使用反应型乳化剂以减少离子型乳化剂的使用量 . 反应型乳化剂在乳化剂分子中含有能发生自由基聚合反应的双键 ,在反应时参与单体共聚 ,不以游离聚合物粒子形式存在 ,从而改善粘接剂的性能 5,8 . 综上所述，本研究采用 MTT 法评价细胞毒性 ,其结果显示FPSA 1无明显的细胞毒性 ,具有良好的细胞相容性 ,是一种具有发展 前景的颜面赝复体粘接材料 . 【参考文献】 1 Chang TL, Garrett N, Roumanas E, et al. Treatment satisfaction with facial prostheses J . J Prosthet Dent, XX,94(3):275-280. 2 Kiat Amnuay S, Gettleman L, Goldsmith LJ. Effect of multi adhesive layering on retention of extraoral maxillofacial silicone prostheses in vivo J . J Prosthet Dent, XX,92(3):294-298. 3 Dahl JE, Polyzois GL. Irritation test of 7 / 8 tissue adhesives for facial prostheses J . J Prosthet Dent, 2000,84(4):453-457. 4 ISO 10993 5: Biological evaluation of medical devices Part 5: Tests for in vitro cytotoxicity S . XX. 5 ISO 10993 12: Biological evaluation of medical devices Part 12: Sample preparation and reference materials S . XX. 6 USPC.Biological Tests/Biological Reactivity Tests,in vitro S .XX. 7 郝和平 . 医疗器械生物学评价标准实施指南 M . 北京 : 中国标准出版社 , 2000:100-101. 8 Richardson RR Jr, Miller JA, Reichert MW. Polyimides as biomaterials: Preliminary biocomp