肝细胞损伤与细胞凋亡及肝细胞保护

1 / 14 肝细胞损伤与细胞凋亡及肝细胞保护 提要 细胞凋亡是细胞死亡的形式之一，多数研究显示，在各种肝疾病中，肝细胞损伤的结果可导致肝细胞凋亡，抑制细胞凋亡可达到保护肝细胞损伤的目的，凋亡抑制剂的运用将为临床上防治各种肝损伤提供新的途径。 细胞凋亡 (apoptosis)是细胞死亡形式之一，它以细胞 DNA 发生特异性的降解，形态上表现为核固缩、胞膜发泡和凋亡小体形成为特征，是由特定的基因调控，无明显细胞溶解的自杀过程。诸多生理及病理过程均有凋亡参与调节。近来大量的研究表明，细胞凋亡在肝细胞损伤过程 中发挥重要作用。 1.细胞凋亡与肝疾病 1.1 细胞凋亡与药物性肝炎 1.1.1 常见的肝毒性药物 二甲基亚硝胺、放线菌酮、硫代乙酰胺等均为常见的肝毒性药物。体内及体外试验均发现它们可诱导肝细胞发生凋亡（ 1）。给鼠喂饲四氯化碳可产生经典的急性肝损伤动物模型，既往认为这种肝损伤的结果2 / 14 是坏死，近来 Shi 等（ 2）的研究向这一观点发出挑战，经运用流式细胞仪、透射电镜、电泳及原位末端标记等技术均检测到这种肝损伤动物模型的肝脏存在细胞凋亡。扑热息痛（醋氨酚， acetaminophen）过 量使用可对机体产生严重的肝损害，甚至死亡，其肝损伤机制近年来研究较多，有报道其与凋亡有关（ 3）。 1.1.2 抗肿瘤药物 现在普遍认为，抗肿瘤药的抗癌机理之一为抗肿瘤药诱导肿瘤细胞发生凋亡。也有文献报道抗肿瘤药也可诱导正常肝细胞凋亡，如 Tsuki-date 等（ 4）发现，经秋水仙碱与长春新碱处理后的体外培养的肝细胞，出现细胞凋亡所具有的典型的生化学特征，即梯状 DNA 电泳图谱。联系到许多抗肿瘤药的肝毒性，不难推测其与细胞凋亡有联系。 1.2 细胞凋亡与病毒性肝炎 1.2.1 暴发性 病毒性肝炎 有研究间接认为暴发性肝炎的发生与细胞凋亡有关，因为暴发性肝炎患者血液中可溶性 Fas 配体（ sFas l）含量明显高于正常人，并与血液中 ALT、AST 并行升高，呈明显的正相关（ 5）。 Fas 抗体可诱导鼠发生暴发性肝功衰，蛋白水解酶抑制剂可抑制肝细胞凋亡，减3 / 14 轻 Fas 抗体引起的肝损伤程度（ 6）。 1.2.2 慢性病毒性肝炎 有研究报道，慢性乙肝与丙肝患者肝活检标本中，肝细胞凋亡率明显高于正常人，前者在平均 6 左右，后者在 1 以下，两组在统计学上有显著差异。慢性病毒性肝炎病检中常见嗜酸性小体，局灶 性死亡，现在认为均是调亡的典型表现，而且，经 IFN- 治疗后，肝脏的凋亡情况明显改善，肝功能发生好转（ 7）。这些都提示细胞凋亡与慢性病毒性肝炎有关。 1.3 细胞凋亡与酒精性肝病 给大鼠长期喂饲酒精，鼠肝细胞凋亡的比例会明显增加。 Kawahara 等为研究人酒精性肝病的凋亡情况，通过运用对 Lewis 抗原及断裂的 DNA（两者均为凋亡之表现）的检测，发现除脂肪肝外，处于临床各期的酒精性肝病患者活检标本均发现有凋亡的表现，而且有意义的是凋亡多者转氨酶活动增强（ 8）。 1.4 细胞凋亡与胆源性肝损 伤 胆道梗阻引起肝细胞分泌及排泄胆汁发生障碍，肝细胞内外胆汁浓度升高。体外实验表现，胆汁中的胆红素与胆汁酸可使培养的鼠肝细胞发生凋亡，表现典型的凋亡时的形态学及生化学变化，且呈浓度依赖与时间依赖效应，浓度越高凋亡越多，作用时间越长，4 / 14 凋亡亦增加（ 1）。由此可知，肝细胞凋亡亦可能参与了胆源性肝损伤的病理机制。 1.5 细胞凋亡与脓毒血症引起的肝损伤 Haendeler等（ 9）利用猪内毒休克动物模型观察了肝细胞凋亡的情况，假手术组凋亡率有轻度的升高为对照组的 166%14% ，但脓毒血症组升高更明显，达到 295%11% ，而且在脓毒血症组肝细胞电泳时出现了梯状 DNA 带。 1.6 细胞凋亡与肝缺血再灌注损伤 缺血再灌注可引起肝损伤。 Sasaki 等（ 10）在研究肝缺血再灌注损伤的动物实验发现，缺血再灌注损伤可引起鼠肝细胞凋亡，而且凋亡多发生在再灌注后早期。 Kuo 等（ 11）观察了 35 例临床同种异体肝移植术后肝活检标本的凋亡情况，将缺血再灌注损伤的程度分级，随损伤程度的加重，凋亡的细胞数目增多，轻度损伤者凋亡率为 0.3%0.1% ，而中度与重度损伤分别达1.7%0.3% 与 6 .7%1.6% ，而且凋亡的 程度与缺血再灌注损伤的生化学与病理学参数平行，呈正相关（ 11）。以上研究均提示细胞凋亡与肝缺血再灌注损伤密切相关。 1.7 细胞凋亡与肝移植物排异反应 有人对鼠肝移植标本行组织学检查，不仅凋亡信号阳性，而且细胞凋亡比例5 / 14 随排异反应的演进而增加，随排异反应的消退而减少，细胞凋亡反映了排异反应的严重程度（ 12）。也有研究显示同种异体肝移植鼠动物模型的早期（ 2 7 天），肝酶学指标升高与凋亡指数升高呈平行状态，第 2 天、 3 天、 4 天、 7 天的凋亡指数分别为 0.25%、 0.38%、 0.47%及 1.58%，而 GST 的 含量依次为 74ng/ml、 86ng/ml、 255ng/ml 与 1710ng/ml，而且包括肝实质细胞在内，胆管细胞也发生凋亡。这些也说明细胞凋亡与肝移植引起的排异反应有关（ 13）。 2.细胞凋亡信号的传导 在肝细胞受到损伤时，有些被称为死亡因子的细胞因子被激活，如 Fas l/Fas 抗体， TNF 、 TGF1 、 INF 等，通过与靶细胞上的受体结合，引起凋亡的发生。 2.1 Fas/Apo-1 传导途径 Fas/Apo-1 抗原也称 CD95，是效应细胞表面的一种膜受体，属于神经生长 因子一肿瘤坏死因子受体家族。携带突变的 Fas 基因的转基因大鼠体可抵抗由 Fas 抗体对肝细胞凋亡的诱导。肝细胞表面存在 Fas 受体，体内与体外实验均证实 Fas抗体或 Fas配基可通过与 Fas接合诱导肝细胞凋亡，血清转氨酶增加，引起暴发性肝功衰。大量的研究显示 Fas 介导的细胞凋亡与病毒性肝炎、酒精性6 / 14 肝病、感染性休克、脓毒血症及全身炎性反应综合征引起的肝损害有密切关系（ 5）。 2.2 TNF 及其受体传导途径 TNF 是具有多种生物学效应的细胞因子，对肝脏的生长、炎性反应及细胞毒性均有调节作用。体内及体外实 验均发现， TNF 可诱导肝细胞凋亡，这是因为：（ 1） TNF 不仅诱导肝细胞死亡，而且能介导 Kupffer 氏细胞及肝窦内皮细胞发生凋亡；（ 2）在活体内经予大量的放线菌素 D 导致肝组织内 TNFmRNA 表达增加，凋亡增多，而若经抗 TNF 的血清处理后肝细胞损伤受到抑制（ 16）；（ 3）直接注射 TNF 到活体肝脏内，有凋亡典型的 DNA 梯带出现（ 17）。 TNF 效应通过 2 类细胞表面受体介导，即 TNF -R1 与 TNF -R2。 TNF 引发的凋亡活动主要与 TNF -R1 有关。这提示 TNF 及其受体在肝毒性药物、脓毒血症等引起 的肝损伤方面会起着重要的作用。 2.3TGF1 及其受体途径 TGF1 是抑制上皮细胞生长的多肽家庭族中的一员，是强有力的人或鼠肝细胞 DNA 合成抑制剂。有丝分裂原诱导的发生凋亡的肝脏组织内，TGF1 前体表达明显增加，外源性的 TGF1 可诱导培养的肝细胞发生凋亡，慢性病毒性肝炎及酒精性肝病患者的肝脏TGF1 持续增加（ 1），这些均提示 TGF1 在肝损伤引起的7 / 14 细胞凋亡中起作用。以前认为肝脏只有非实质细胞分泌TGF1 ，现在研究发现肝实质细胞与肝外组织均可分泌TGF1 ，这样 TGF1 可通过自分泌、 旁分泌、远距分泌等方式对肝细胞引发凋亡活动。 TGF1 是通过 TGF1 受体起作用的，其受体有 TGF1 -R1、 TGF1 -R2 与 TGF1 -R3 三种，肝细胞均表达这三种受体，在肝细胞受到损伤时，这三种受体的表达发生上调（ 18）。这些研究也表明 TGF1 及其受体途径在肝细胞凋亡中发挥的重要作用。 2.4INF- 途径 INF- 是激活的 T 细胞及 NK 细胞分解的一种细胞因子，其生物学作用主要是诱导主要组织相容性抗原（ 型与 型）的表达，刺激 TNF 的产生，促进机体对病原微生物的清除。在调节机体的宿主反应 、炎症及自体免疫方面起重要作用。由 cancanaval-in a(Con-A)诱导的急性肝损伤动物的肝组织内凋亡率明显增高的同时， INF-也增加，抗 INF- 血清不仅能降低肝损伤的程度，亦能改善肝细胞凋亡的情况（ 19）。在带有 INF- 缺陷 基因的转基因鼠体内由 Con A 诱导的肝损伤活动受到抑制，在免疫性肝炎、病毒性肝炎、肝移植排异性反应病人发生肝损伤时，INF- 明显较正常人增高（ 20）。这都说明 INF- 与肝损伤、肝细胞凋亡间有密切关系。 8 / 14 2.5 颗粒 -排粒途径 T 细胞被激活后，释放含穿孔素与颗粒酶的颗粒，在 Ca2 的借助下，颗粒在靶细胞膜上穿孔，进而颗粒酶（ granzyme)进入靶细胞内，引起靶细胞 DNA降解活动。对这种颗粒酶的研究也较多，已从人及鼠体内提取了 10 余种酶，目前认为起主要作用的是 granzyme a 与granzyme B（ 12）。 无论是受体介导的传导，还是通过颗粒 -排粒途径，细胞凋亡时，在引起 DNA 降解之前几乎都存在一个共同的通路，即靶细胞内的蛋白水解酶（ Caspase)的激活，尤其是蛋白水解酶 3 的激活最为重要（ 22）。 3.抑制细胞凋亡，保护肝细胞 近年来，随着研究的深入，相继发现及研制了多种凋亡抑制剂，运用凋亡抑制剂可达到保护肝细胞的目的，但对它们研究仍处于体外实验与动物实验水平。 3.1 蛋白水解酶抑制剂与肝细胞保护 如前所述，蛋白水解酶激活，是凋亡细胞 DNA 降解的前提，尤其是蛋白水解酶 3 的激活可以说是必经之路，那么抑制这些蛋白水解酶的激活也会达到抑制凋亡的目的，有研究亦证实这一假说，9 / 14 如 Kunstle 等（ 23 ）运用蛋白酶抑制剂7-VAD-fluoromethylketone（ FMK）可以保护鼠肝脏 免受 Fas l 或 TNF- 诱导急性肝损伤，并呈浓度效应关系。 3.2 外源性 cAMP 与肝细胞保护 外源性的 cAMP 使肝细胞凋亡发生抑制，同对照组相比，明显改善鼠肝损伤的情况。将 CP-cAMP（ cAMP 之供体）直接作用于培养的鼠肝细胞，可抑制胆酸诱发的肝细胞凋亡活动，保护肝细胞，减轻其损伤程度（ 24）。 3.3 一氧化氮（ NO）与肝细胞保护 体内及体外试验表明， NO 在肝细胞凋亡中起重要作用，如将携带有含 NO 的药物，这种药物在肝脏代谢后，释放出 NO 使肝脏局部达到高浓度 NO，结果这种方法能有 效地保护肝细胞受 TNF 及放射菌素 D 所诱导的凋亡，而几乎不影响体循环血流动力学（ 25）。最近，还有学者利用携带有 NO 合成酶基因的腺病毒处理体外培养的肝细胞，以便使肝细胞内 NO 合成酶表达增加，以致 NO的合成增加，结果发现肝细胞能较好地抵抗 TNF与放线菌素 D 对其诱导的凋亡活动（ 26）。 精氨酸是 NO 的供体，在一个肝缺血再灌注损伤的动物实验中，给猪提供外源性精氨酸（ 540 mg/kg,iv)后发现，10 / 14 同对照组相比，实验组动物的凋亡指数明显降低，动物存活时间延长，循环血中肝功能指标明显得到改善（ 27）。 3.4 促增殖剂与肝细胞保护 角质细胞生长因子（ KGF）属于成纤维生长因子家族中的一员，其有促进上皮细胞增殖的作用。体内与体外实验均证实， KGF 可抑制 TNF与 D-galactosanine（ GalN）诱导的肝细胞凋亡，保护它们诱导的暴发性肝细胞损伤（ 28）。降脂素（ Nafenopin)是一种过氧化酶体类的促增殖剂，给小鼠长期喂饲降脂素可诱发肿瘤，但其对 TGF 诱导的鼠肝细胞凋亡有明显的抑制作用，实验组比对照组之凋亡率减少 50% 60%（ 29）。以上均提示运用促增殖剂可抑制肝细胞凋亡。 3.5 其他 近来，其他的肝细胞凋亡抑制剂尚有衣霉素。衣霉素能抑制蛋白发生糖其他反应，体内与体外实验显示，它可抑制 TNF 诱导的肝细胞凋亡，降低肝损伤程度（ 30）。 4.小结与展望 近来的研究多认为各种病因引起的肝细胞损伤与细11 / 14 胞凋亡有密切的关系，抑制肝细胞凋亡可以达到保护肝细胞的作用。虽然在这一方面研究仍处在体外实验及动物实验水平，但是随着研究的深入各种凋亡抑制剂的运用可望为临床上各种肝疾病如急性病毒性肝炎、脓毒血症或炎性反应综合征、药物性肝炎、肝缺血再灌注损伤、肝移植物的排 异反应等引起的肝损伤的防治及在供肝的保护方面提供新的思路，探索新的路径。 参考文献 1.Patel T,et al.Hapatology 1995;21(6):1725-2741. 2.Shi J,et al.Am J Pathol 1998;153(2):512- 525. 3.Ray SD,et al. 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