应激对肉鸡盲肠菌群的影响及维生素C的缓解作用.doc

应激对肉鸡盲肠菌群的影响及维生素C的缓解作用 刁海涛，郑秀娟，周飞，姚维剑，韩雨，贺绍君 （安徽科技学院，安徽凤阳233100） 基金项目：安徽省科技厅自然科学基金项目（1508085QC61）；安徽省大学生创新创业训练项目（AHxx10879071；AHxx10879033） 摘要：目的：研究肉鸡由于多种原因发生应激对其盲肠微生物菌群的影响及饮水中添加维生素C的缓解作用.方法：试验选用AA肉鸡60只，随机均分为三个组即对照组、应激组、VC+应激组.试验从肉鸡21日龄开始，持续3w.对照组常规饲养，应激组于21d开始通过胸肌注射地塞米松模拟肉鸡发生应激，连续注射地塞米松7d，VC+应激组注射地塞米松的同时饮水中按0.2%浓度剂量添加VC至42d.分别在28、35、42日龄剖检取肠道样品，测定肉鸡盲肠内乳酸杆菌、双歧杆菌、大肠杆菌的数量.结果：与对照组相比，28、35、42日龄肉鸡盲肠内乳酸杆菌的数量显著降低（P0.01），大肠杆菌的数量显著提高（P0.01），35、42日龄肉鸡盲肠内双歧杆菌的数量显著降低（P0.01或P0.05）.VC添加组与应激组相比，在28、35、42日龄肉鸡盲肠内乳酸杆菌和双歧杆菌的数量明显提高（P0.01或P0.05）；大肠杆菌的数量显著降低（P0.01）.结论：应激降低了肉鸡盲肠内的乳酸杆菌和双歧杆菌的数量降低，增加了大肠杆菌的数量，维生素C能够在一定程度上缓解应激对肉鸡盲肠内微生物菌群的影响. 关键词：应激；肉鸡；乳酸杆菌；双歧杆菌；大肠杆菌 ：S831：A：1673-260X（xx）08-0034-03 近年来随着养殖业的迅速发展，肉鸡养殖多采用规模化、集约化的养殖模式.此种养殖模式的肉鸡生产容易由于饲养管理水平低下导致各种各样的应激发生，影响养殖者的收益.应激已成为影响当前和今后一段时间影响肉鸡养殖业发展的重要因素.关于动物应激反应机制的研究表明，应激时机体会释放糖皮质激素以适应应激环境，且表明应激损伤肠道屏障，继而肠道内毒素侵入体内是导致一系列应激症状的核心1.例如在热应激过程中，胃肠道是热应激损伤的敏感部位，最容易发生缺血缺氧性损害，其结构和屏障功能也最易受到破坏，导致肠道通透性增加，进而引起肠源性感染，严重者可引起全身炎症反应综合征，甚至多脏器功能衰竭而死亡2.研究表明，应激时使肉鸡的消化机能减退，生产性能降低，并且消化道内各种消化酶活性降低，造成对饲料的消化率降低，损伤肠道系统3-5.家禽胃肠道微生物区系的平衡对维持健康起着重要作用.本试验以对应激特别敏感的肉鸡为研究对象用胸肌注射糖皮质激素的方法模拟动物应激反应探讨应激条件下肉鸡盲肠内的主要细菌群落的变化以及通过在饮水中添加维生素C的方式，从肠道微生物菌群的角度研究应激对肉鸡的影响以及为应激防治提供切实可行的措施. 1材料与方法 1.1试验材料 AA肉鸡、麦康凯培养基、MRS培养基、TPY培养基（上海盛思生化科技有限公司）、隔水式恒温培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）、无菌操作台（苏净集团安泰公司制造）、手提式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）等. 1.2试验设计 试验选用1日龄的AA肉鸡60随机分为3组，分别为对照组、应激组和VC+应激组，每组20只肉鸡，试验从21d开始，对照组正常饲养生长，应激组连续注射地塞米松（2mg/kg体重）7d，VC+应激组注射地塞米松（2mg/kg体重）的同时，饮水按0.2%浓度剂量添加VC至42d，正式试验3w. 1.3饲养环境管理 进雏前搞好消毒工作进雏前7天冲洗地面墙壁及育雏设备.进雏前5天甲醛熏蒸消毒按每立方米空间30ml甲醛15g高锰酸钾对鸡舍进行熏蒸.试验鸡采用笼养方式按7d接种新城疫，滴鼻或点眼，14d饮水接种法氏囊疫苗进行免疫.自由采食和饮水定期清理粪便预试2w，定时观察温度、湿度，控制好饲养环境，第3w进入正式试验期. 1.4测定指标与方法 1.4.1测量指标 分别于21、28、35、42日龄每组随机选取5只鸡颈静脉放血法处死，打开腹腔结扎盲肠两端并剪下，放入无菌样品盒中待测.采用倾注平板法对盲肠中大肠杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌计数. 1.4.2具体方法 （1）灭菌.试验前一天把事先准备好的试验用品高压蒸汽灭菌. （2）稀释.无菌操作台内把盲肠剪开，称取盲肠内容物0.5g，放入无菌的试管中，加入灭菌的生理盐水4.5mL，振荡，制成10-1稀释液，用移液枪准确吸取该稀释液0.5mL到盛有4.5mL事先灭菌的试管中，振荡，制成10-2稀释液，依次进行稀释到10-7. （3）接种和培养.大肠杆菌利用麦康凯培养基计数，乳酸杆菌利用MRS培养基计数，双歧杆菌利用TPY培养基计数，分别吸取10-5和10-6稀释液于无菌培养皿中，每个稀释度2个重复. （4）计数.细菌进行培养后按可数性原则计数.大肠杆菌选取粉红色或红色表面光滑、凸起、边缘整齐不透明、直径22.5mm的圆形菌落进行计数.乳酸杆菌选取乳白色表面光滑、凸起、边缘整齐不透明、直径12mm的菌落进行计数.双歧杆菌选取菌落光滑、凸圆、边缘完整、乳脂至白色的双歧杆菌进行计数. 1.5数据处理 数据统计利用SPSS18.0软件的ANOVA进行数据分析，用LSD法进行各组间多重比较.P0.05和P0.05）.在28d、35d、42d时，与对照组相比，应激组和VC+应激组肉鸡盲肠内乳酸杆菌数量明显降低，且差异极显著（P0.01）.VC+应激组与应激组相比，肉鸡盲肠内乳酸杆菌数量均升高，且差异极显著（P0.05）.在28d时，各实验组肉鸡盲肠内双歧杆菌数量差异不显著（P0.05）.在35d和42d时，与对照组相比，应激组和VC+应激组肉鸡盲肠内双歧杆菌数量均明显下降，差异显著或极显著（P0.05或P0.01）；VC+应激组与应激组相比，肉鸡盲肠内双歧杆菌数量有明显升高，差异极显著（P0.05）.在28d时，与对照组相比，应激组和VC+应激组肉鸡盲肠内大肠杆菌数量均明显升高，且差异极显著（P0.05）.在35d时，与对照组相比，应激组和VC+应激组肉鸡盲肠内大肠杆菌数量均升高极显著（P0.01）；VC+应激组与应激组相比，肉鸡盲肠内大肠杆菌数量有明显下降（P0.01）.在42d与对照组相比，应激组肉鸡盲肠内大肠杆菌数量增高了9.03%，差异极显著（P0.01）；VC+应激组与应激组相比，肉鸡盲肠内大肠杆菌数量明显降低，且差异极显著（P0.01）. 3讨论 3.1应激与乳酸杆菌的关系 乳酸杆菌目前是广泛应用的一种肠道益生菌，它是温血动物肠道中的优势菌群6.虽然乳酸杆菌不是鸡肠道内的优势菌群，但普遍认为乳酸杆菌是鸡肠道的正常菌群成员7，8.应激时会对肉鸡肠道内的微生物菌群产生一定影响，研究报道，受到热应激时鸡空肠和盲肠中的乳酸杆菌群数量减少，微生态平衡被破坏9.本实验结果显示，应激时，28d、35d、42d肉鸡盲肠内的乳酸杆菌的数量降显著（P0.01），与上述结果是一致的.同时在饮水中添加VC可以缓解应激对肉鸡肠道的损伤作用，有助于恢复肠道内乳酸杆菌的数量.由上述可知，肠道是应激损伤的主要靶器官，盲肠内的乳酸杆菌的稳定对肠道健康的维护有重要的作用，应激时乳酸杆菌的平衡被打破，就会引起乳酸杆菌的数量发生变化，造成对机体的影响. 3.2应激与双歧杆菌的关系 双歧杆菌和乳酸杆菌一样都是肠道内正常的菌群，在维护肠道健康和微生物平衡上具有重要作用.双歧杆菌作为机体肠道内的优势菌、指示菌之一，对人体有着重要的保健功能10，11.研究报道，应激时会使肉鸡空肠和盲肠内的双歧杆菌的数量减少，微生态平衡被破坏，试验结果显示，应激时35、42日龄肉鸡盲肠内双歧杆菌数量显著降低（P0.01或P0.05）.28、35、42日龄应激组肉鸡盲肠内大肠杆菌数量显著增高（P0.01），VC添加组在一定程度上减少了大肠杆菌的增高.由上述可知，盲肠内含有一定数量的大肠杆菌，与其他微生物构成盲肠内的微生物系统，共同维持着肠道内微生态的平衡，应激时大肠杆菌的平衡被打破，就会引起大肠杆菌的数量发生变化，导致大肠杆菌病的发生，造成严重的经济损失. 4小结 本试验结果表明应激可导致肉鸡盲肠乳酸杆菌和双歧杆菌的数量显著降低，大肠杆菌的数量显著提高，导致盲肠菌群失调，在饮水中添加一定量的VC在一定程度上可缓解应激损伤，恢复肠道菌群平衡. 参考文献： （1）叶强，欧希龙.应激致肠道屏障功能损伤的机制J.现代医学，xx，39（5）：619-622. （2）戴四发，王立克，王立新，等.谷氨酰胺对热应激条件下肉鸡生产性能，肠道消化酶活和形态结构的保护作用J.中国粮油学报，xx，24（4）：103-107. （3）Quinteiro-FilhoWM，GomesAVS，PinheiroML，etal.HeatstressimpairsperformanceandinducesintestinalinflammationinbroilerchickensinfectedwithsalmonellaenteritidisJ.AvianPathology，xx，41（5）：421-427. （4）MitchellMA，CarlisleAJ.Theeffectofchronicexposuretoelevateenvironmentaltemperatureonintestinalmorphologyandnutrientabsorptioninthedomesticfowl（Gallusdomestic）J.ComparativeBiochemistryandPhysiologypartA：Physiology，1992，101，137-142. （5）宁章勇，刘思当，赵德明，等.热应激对肉仔鸡呼吸、消化和内分泌器官的形态和超微结构的影响J.畜牧兽医学报，xx，34（6）：558-561. （6）TannockGW.NewconceptsinhealthpromotionJ.Thenormalmicroflora，1998，5（1）：4-8. （7）ParkSH，HanningI，PerrotaA，etal.ModifyingthegastrointestinalecologyinalternativelyraisedpoultryandthepotentialformolecularandmetabolomicassessmentJ.PoultryScience，xx，92（2）：546-561. （8）EhrmannMA，KurzakP，BauerJ，etal.CharacterizationoflactobacillitowardstheiruseasprobiobicsadjunctsinpoultryJ.JournalofappliedMicrobiologyxx，92：966-975. （9）唐磊，李文立，将建阳，等.谷氨酰胺对热应激盲肠微生物区系影响J.中国兽医学报，xx，33（1）：80-84. （10）SimpsonPJ，StantonC，FitzgeraldGF，etal.GenomicdiversityandrelatednessofbifidobacteriaisolatedfromaporcinececumJ.JournalofBacteriology，xx，185（8）：2571-2581. （11）DengW，DongX，TongJ，etal.Theprobioticbacilluslicheniformisamelioratesheatstress-inducedimpairmentofeggproduction，gutmorphology，andintestinalmucosalimmunityinlayinghensJ.Po