响应面法对漆斑菌液体发酵产胆红素氧化酶条件的优化.doc

响应面法对漆斑菌液体发酵产胆红素氧化酶条件的优化 刘友勋，闫明阳，赵春澎，黄娟 （新乡医学院基础医学院，河南新乡；华中科技大学生命科学与技术学院，武汉） 摘要：对漆斑菌（）菌株液体发酵产胆红素氧化酶的条件进行了优化。采用单因素试验筛选出最适碳源为葡萄糖，氮源为硝酸铵，为，温度为和最有效促进产酶的金属离子为。在此基础上，利用设计对影响产酶因素的效应进行评价，筛选出具有显著影响的3个因素葡萄糖、和温度。用最陡爬坡路径逼近最大产酶区域后，利用响应面中心组合设计对显著因素进行优化，得出、温度和葡萄糖分别为、时，优化后液体发酵液中胆红素氧化酶活力提高到，比未优化前的酶活力提高了近2倍，结果表明单因素与响应面结合法可优化菌株液体发酵产胆红素氧化酶的条件。 关键词：胆红素氧化酶；漆斑菌（）；设计；响应面法 ：A：0439114（15）051150-05 DOI：10.14088/j.ki.issn0439-8114.xx.05.031 ： 基金项目：国家自然科学基金项目（）；河南省教育厅科学技术研究重点项目（） 作者简介：刘友勋（），男，湖北鄂州人，副教授，博士，主要从事酶工程及生物转化研究，（电话电子信箱）； 通信作者，黄娟，讲师，主要从事酶工程研究，（电子信箱）。 漆斑菌属（）是一种无性型丝状真菌，属于半知菌亚门丝孢纲丝孢目瘤座孢科（）。漆斑菌属是产胆红素氧化酶的主要真菌，工业上常用该属菌株生产胆红素氧化酶（，）。胆红素氧化酶是一种含铜的多酚氧化酶，能催化胆红素氧化，氧气是其电子受体。反应过程为胆红素氧化酶催化胆红素生成胆绿素，后者可进一步氧化最终生成无色化合物。在临床检验中，常使用胆红素氧化酶来测定血液中胆红素的含量。相比较其他胆红素测定方法，酶学方法具有特异性、灵敏度高和操作简便等优点，适用于临床手工或自动化检测，。近年来，由于胆红素氧化酶的底物范围广和氧化能力强，目前已被用于生物电池的制造、污水处理等方面的研究。 响应面法是利用合理的试验设计并通过试验得到的一定数据，采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法。该方法在优化研究中应用频繁，是降低开发成本、优化加工条件、提高产品质量、解决生产过程中实际问题的一种有效方法，已广泛地应用于农业、生物、食品、化学、制造等领域。为了提高漆斑菌产的能力，使其产酶量达到工业生产规模的需求，本试验对漆斑菌菌株在液体培养体系中发酵产酶的影响因子进行了研究和优化。 材料与方法 材料与仪器 供试漆斑菌，从武汉植物园土壤中分离得到；，连氮双（乙基苯并噻唑磺酸铵）（）,美国公司；马铃薯液体培养基（）：马铃薯（削片煮水）葡萄糖。 紫外可见分光光度仪（型），上海尤尼柯仪器有限公司；台式高速冷冻离心机（型），湖南湘仪集团；全温气浴振荡摇床（型），金坛市成辉仪器厂。 方法 液体培养I菌株斜面培养于培养基中，静置，通常可产生大量的分生孢子，用适量的蒸馏水将试管中的孢子冲洗出来，通过显微计数，将孢子数量调整到个，使用前将孢子悬浮液摇匀。用移液枪吸取不同量孢子液注射入灭菌后的培养基中。将接种的培养基放在摇床中，下振荡培养，根据需要调整培养液的起始和培养温度。菌株在液体基质中培养一段时间后，将菌丝过滤即得到粗酶液。 酶活测定酶活测定采用法，参考文献。在反应体系中，含有的乙酸乙酸钠缓冲液、酶液、，按次序混合并摇匀，后开始记录，每隔记录一个值。一个酶活力单位（）：在上述条件下，每分钟催化氧化所需的酶量。 2.单因素试验筛选漆斑菌培养的最适碳源、氮源、温度和金属离子。碳源。采用不同碳源木糖、甘露糖、蔗糖、葡萄糖、微晶纤维素添加到培养基中，测定菌株产的相对酶活；氮源。采用有机氮源（蛋白胨、尿素、酵母浸膏）和无机氮源（硝酸铵、硫酸铵）添加到培养基中，测定菌株产的相对酶活；。调节培养基使其处于不同的（、），测定菌株产的相对酶活；温度。在不同的温度下培养（、），测定菌株产的相对酶活；金属离子。在培养基中添加不同金属离子（、g、），测定菌株产的相对酶活。 3响应面设计和统计分析 结果与分析 单因素试验结果 不同碳源和氮源的影响如图所示，在对照培养基中，菌株生长良好，但产酶量不大；在加入蔗糖和葡萄糖的培养基中，产量是对照的倍；在加入微晶纤维素的培养基中，菌株生长慢，但产量是对照的倍左右；在加入木糖和甘露糖的培养基中，菌株生长速度一般，产量比较低。结果表明，在对照培养基中，由于缺乏速效碳源，从而影响了的产量；葡萄糖作为速效碳源可明显提高产量，蔗糖也有类似的效果，可能是因为蔗糖水解后也可产生葡萄糖；而木糖和甘露糖对菌株生长和的分泌具有一定的抑制作用；微晶纤维素虽然不能促进菌株的生长，但可以促进其产酶。 如图所示，和对照相比，在不同氮源中硝酸铵对菌株产酶有明显的促进作用，而尿素对产酶有抑制作用。有机氮源（蛋白胨、尿素、酵母浸膏）和无机氮源（硝酸铵、硫酸铵）相比，无机氮源作为一种速效氮源对产酶的影响较大。 不同的影响如图所示，培养基为是该菌产酶的最适，在中性偏碱性的环境（9）中，产量要比在酸性环境高，且在、时菌株IMER1生长较差，而在碱性环境下，生长较好。表明菌株作为一种耐碱性真菌，在中性偏碱性的范围内能较好地分泌。 不同温度的影响如图所示，时菌株的生长速度快，产量最大，而在较低温度时，该菌株生长较慢，酶产量也较低；在时，菌株的孢子未能萌发，所以在其发酵液中未测到酶活。结果表明，最适的产酶温度为，高温会抑制孢子的萌发。 不同金属离子的影响如图所示，和对菌株产有一定的抑制作用，、对产酶的影响较小，、离子对产有一定的促进作用，而对其产酶的促进作用最强。 响应面法优化液体培养体系产酶条件 主效因素的确定（）法是一种近饱和的水平试验设计方法，它基于非完全平衡块原理，能用最少的试验次数估计出因素的主效应，从众多的考察因素中快速有效地筛选出最为重要的几个因素供进一步研究。根据上述单因素试验结果，影响菌株液体发酵产酶的可能因素包括温度、氮源、碳源（葡萄糖，）、铜离子等。选用的设计，并设个空白作为误差分析项，结果见表，各因素所代表的参数及因素效应评价见表。由表可知，对菌株液体发酵产酶有显著影响的因素有碳源、和温度。温度对产酶呈正效应，碳源和则呈较大的负效应。要提高产酶量，应适当提高温度，降低葡萄糖的浓度。 最陡爬坡试验确定响应面试验因素水平的中心点根据法筛选出的显著因素效应大小设定它们的步长，进行最陡爬坡试验设计，寻找最大产酶区。根据、和温度个因素效应大小的比例设定它们的变化方向及步长，最陡爬坡试验设计及试验测得结果如表所示，最大产酶区在第次试验附近，故以试验的条件为响应面试验因素水平的中心点。根据试验和最陡爬坡试验确定的试验因素与水平详见表。 响应面设计确定显著因素的最优水平利用最大产酶区对应的条件进行响应面中心组合试验设计，以试验结果拟合建立描述响应量（BOX酶活）与自变量（影响产酶的显著因素）关系的多项式回归模型，运用软件对试验数据进行回归拟合，并对拟合方程作显著性检验及方差分析。三因素五水平的响应面中心组合试验设计及试验测得的酶活力结果见表。 ）回归模型的建立及置信度分析。以酶活为响应值，根据表的试验结果，用统计分析软件进行多元回归分析，所得的主要分析结果见表、表。从方差分析中可以看出，各试验因素响应值的影响不是简单的线性关系。根据试验因素对响应值的影响，拟合得到多项式回归模型为：。 从表中可以看出，用上述回归方程描述各因素与响应值之间的关系时，其因变量和自变量之间的线性关系是显著的，决定系数为，说明回归方程的拟合程度很好。 ）显著因素水平的优化和验证。运用软件对回归模型进行规范性分析，寻求最大酶活量的稳定点及对应的因素水平，结合图的回归方程的三维响应面图和等高线图可知，回归模型存在稳定点，对应的、实际取值分别为、，酶活的最大估计值为。在以上优化条件下进行验证试验，共进行次的摇瓶试验，酶活分别为、，平均值为。证明预测值与试验平均值非常接近，同时比没有优化前的酶活力提高了近2倍。 小结 漆斑菌属是产的主要真菌，有关其产酶条件的优化报道不多。多数微生物产酶条件优化采用单因素试验、正交试验及响应面试验分析，这些方法存在一定的缺陷。本试验通过整合单因素试验和设计，结合最陡爬坡路径试验和响应面中心组合设计，对菌株在液体培养体系中高效产胆红素氧化酶条件进行了优化，获得了比较理想的结果。菌株以培养基为基础，在外加碳源和氮源中，葡萄糖、蔗糖和硝酸铵能提高产量；在中性偏碱性的79范围内，产量要比在酸性条件下高，其最适产酶为；最适产酶温度为；在培养基中加入对产有明显的促进作用。运用响应面法优化液体体系产酶的条件，结果表明，在、温度、碳源和氮源等影响因素中，、温度和碳源属于主效因子。当、温度和葡萄糖分别为、时，酶活力可达到最大优化值，比没有优化前的酶活力量提高近2倍。 参考文献： 吴文平河北省丝孢菌研究、漆斑菌属（：）的四个种河北省科学院学报，（1）： 王菊君，曹恩华，赵英霞疣孢漆斑菌（v）胆红素氧化酶的纯化及性质初步研究中国生物化学与分子生物学报，（）： ，（）： ，BB，（）： ，（）： 赵晓瑜，刘彬彬，杨茂华，等终止剂法测定胆红素氧化酶活性河北大学学报（自然科学版），（）： 康峰，伍艳辉，李佟茗生物燃料电