反式白藜芦醇对痴呆大鼠海马NMDAR1尧NMDAR2A表达的影响.doc

反式白藜芦醇对痴呆大鼠海马NMDAR1尧NMDAR2A表达的影响 王顺旺1叶水龙1许文勇1刘文娟1徐平2 1.厦门市第三医院神经内科，福建厦门361100；2.遵义医学院附属医院，贵州遵义563003 摘要目的探讨反式白藜芦醇（TR，Trans-Resveratrol）对A25-35损伤大鼠海马NMDA受体NR1、NR2A亚基表达的影响。方法选择经莫式水迷宫(MWM)训练合格的大鼠，随机分为6组：假手术组；模型组；TR高剂量组、TR中剂量组、TR低剂量组、安理申对照组。模型组通过在大鼠海马内注射A25-35制模获得，在模型组基础上分别用TR高、中、低剂量TR干预获得TR高剂量组、TR中剂量组、TR低剂量组，同时用安理申干预获得安理申对照组，每组6只，采用实时聚合酶链反应法(realtimePCR)检测6组大鼠海马NMDA受体NR1、NR2A表达。结果在MWM中模型组逃避潜伏期比TR高、中、低剂量组、安理申组和假手术组明显延长，各组NMDA受体NR1表达分别为(0.140.04),(1.510.54),(0.220.06),(0.370.08,0.61)0.15)(LOW)，(0.970.16)(安理申)。各组NMDA受体NR2A表达分别为(0.120.07)、(1.720.34)、(0.160.06)、(0.210.08)、(0.520.15)、(0.670.16)。结论TR可能有下调海马NMDAR1、NMDAR2A受体表达，从而减少海马细胞凋亡的作用。 关键词反式白藜芦醇；痴呆；大鼠；nmda受体 R725A1674-074（4）09（c）011-03 海马是学习记忆的重要脑区，是边缘系统的一个部分1。NMDA受体是谷氨酸受体的一种亚型，参与形成突触传递的长时增强过程，参与调解神经系统的发育，同时在癫痫、肿瘤等多种重要过程中发挥重要作用2-3。目前已经发现的NMDA受体多达7种，包括NR1、NR2（A、B、C和D4种）、NR3（A、B2种），NR2各亚单位之间具有很好的相似性，一般将其分为2种亚群4。研究表明，反式白藜芦醇(Trans-Resveratrol,TR)具有一定的抗氧化作用，在防止高血压、动脉硬化及提高机体免疫力方面有较好的效果5。 研究发现，利用基因敲除技术敲除NR1基因后，小鼠CA1区NMDA受体兴奋性突触后电位消失，痴呆大鼠的海马突触传递发生改变，其海马的NR2A表达轻度上调，NR1表达明显上调。经TR干预后海马及附近脑组织NR1、NR2A表达均下调9。因此，我们使用颅钻钻孔微注棒A25-35注射损伤双侧大鼠海马7-8,注射TR后，观察其对痴呆大鼠保护的效果，并检测NMDA受体NR1、NR2A的表达情况，以探求临床上痴呆病人理想药物治疗的实验研究方法，现报道如下。 1资料与方法 1.1一般资料 实验用36只雄性大鼠为本单位实验动物研究中心提供，体重208225g，平均体重215g。反式白藜芦醇(TR)粉剂购自西安林禾生物技术有限公司。苦味酸购自生工生物工程（上海）有限公司，盐酸多奈哌齐（安理申）购自卫材（中国）药业有限公司，A25-35购自SIGMA公司，逆转录试剂、荧光液GreenSupermix等PCR试剂购自生工生物工程（上海）有限公司。 1.2仪器 冷冻离心机（德国5417R）、紫外可见分光光度计（TU-1810）、湘仪H1650-W离心机，ThermoPikoReal96Real-timesystem实时PCR仪，BioerXPCycler普通PCR仪、双臂脑立体定位仪（68002型RWDlifescienceco）、颅钻（78001型）、超微量注射棒、Morris水迷宫等。 1.3动物模型制备 选择经莫式水迷宫(MWM)训练合格的大鼠，随机分为6组：假手术组；模型组；TR高剂量组、TR中剂量组、TR低剂量组、安理申对照组。模型组通过在大鼠海马内注射A25-35制模获得，在模型组基础上分别用TR高、中、低剂量TR干预获得TR高剂量组、TR中剂量组、TR低剂量组，同时用安理申干预获得安理申对照组。 1.4NMDA受体NR1、NR2A表达检测 利用RT-PCR检测NMDA受体NR1、NR2A的表达，方法参照检测试剂盒进行，PCR反应条件采用两步法进行,具体步骤为：95，3min；65，3min。 1.5统计方法 应用SPSS18.0统计软件分析所有数据，计量资料以（xs）表示，组间比较用Levene检验分析。 2结果 21各组NMDA受体NR1、NR2A表达 各组NRI及NR2A的表达结果见表1，与模型组相比，各组NR1及NR2A的表达差异有统计学意义（P0.05），且高剂量组反式白藜芦醇干预组的NR1的表达明显减少，与中、低剂量反式白藜芦醇干预组相比效果好。 2.2TR各剂量组海马凋亡细胞病理观察 TR各剂量组海马凋亡细胞病理切片结果如图1所示，TR高剂量组海马的凋亡细胞数明显低于TR低剂量组、对照组及模型组，TR低剂量组海马凋亡细胞数相对对照组及模型组较少。 3讨论 海马是人类脑部的重要区域，具有调解神经系统的发育的重要作用，是边缘系统的一个部分，海马受损是引起阿尔茨海默病的主要病因6-7。 NMDA受体是谷氨酸受体的一种亚型，参与形成突触传递的长时增强过程，研究发现当海马神经元突触内NMDA受体被阻断时，细胞变性死亡将会增加8-10。海马中主要表达的NMDA受体有NR1和NR2A，NR1可以在细胞中单独表达有功能的同聚受体，但对激动反应很小，NR2A不能单独形成有功能的通道，只有和NR1组合才能表现活性，并使后者反应明显加强，所以把NR1、NR2A放一起研究并起互相印证的作用11-13，研究发现，谷氨酸可能在神经病理变化及痴呆症状中起重要作用，在有痴呆的大鼠甘氨酸结合能力降低,提示NMDA受体的功能缺损，Lu等15采用免疫印迹法分析AD患者死后脑NR1下降39%,NR2B下降40%，提示NMDA受体的功能缺失后,AD患者嗅内皮质中NR1mRNA含量较正常人下降34%，而用用高压液相色谱分析脑组织标本中的右旋-天冬氨酸含量发现16AD患者的天冬氨酸较相同年龄正常对照组下降，但在神经病理变化较小的小脑中无明显变化，这些说明右旋-天冬氨酸的降低可能参与NMDA受体功能下调及记忆丧失的过程。Hasanein等17则发现AD患者神经受损区具有特异性，A25-35在AD患者脑内堆集、产生神经毒性可能是通过NMDA受体促进氧自由基的生成所引起的18，所以该实验通过检测NMDA受体含量变化，推测抗氧化药物白藜芦醇是否对痴呆大鼠有作用，结果发现随着TR剂量的增加，海马组织NMDA受体的表达减少，痴呆症状有所改善，TR对痴呆大鼠海马起到保护作用，TR对大脑海马的保护作用可能是通过下调海马中NMDA受体NR1及N2A的表达完成的，但其具体作用机制还需要进一步研究发现。 参考文献 1王燕.白藜芦醇的生物学功能及其应用前景J.中国饲料,xx(16):22-24. 2MuralidharanP,V.R.KumarandG.Balamurugan,ProtectiveeffectofMorindacitrifoliafruitsonbeta-amyloid(25-35)inducedcognitivedysfunctioninmice:anexperimentalandbiochemicalstudyJ.PhytotherRes,xx，24(2):252-258. 3DanyszW.CGParsons,Alzheimersdisease,beta-amyloid,glutamate,NMDAreceptorsandmemantine-searchingfortheconnectionsJ.BrJPharmacol,xx，167(2):324-352. 4LiuZ.NR2B-containingNMDAreceptorsexpressionandtheirrelationshiptoapoptosisinhippocampusofAlzheimersdisease-likeratsJ.NeurochemRes,xx，37(7):1420-1427. 5Adams,M.M.,J.H.MorrisonandA.C.Gore,N-methyl-D-aspartatereceptormRNAlevelschangeduringreproductivesenescenceinthehippocampusoffemaleratsJ.ExpNeurol,xx,170(1):171-179. 6刘小莉,陈虹.阿尔茨海默病动物模型研究概况J.山东医药,xx(11):76-77. 7杨晓娟.新型复合式老年痴呆动物模型的建立J.中西医结合心脑血管病杂志,xx(4):318-320. 8陈怡,李明,王庆山.白藜芦醇对中枢神经系统保护作用的研究进展J.武警医学,xx(10):780-782. 9李明.白藜芦醇抑制大鼠海马CA1区神经元放电(英文)J.生理学报,xx(3):355-360. 10林奕斌,赵同军,展永.N-甲基-D-天氡氨酸受体的分子结构与生理功能J.生物学杂志,xx(1):1-4. 11LiptonSA.ThemolecularbasisofmemantineactioninAlzheimersdiseaseandotherneurologicdisorders:low-affinity,unpetitiveantagonismJ.CurrAlzheimerRes,xx,2(2):155-165. 12黄春桃,吴锡南，刘苹.N-甲基-D-天冬氨酸受体在中枢神经系统的研究进展J.中国行为医学科学,xx(4):377-378. 13VanhoutteP,HBading.OpposingrolesofsynapticandextrasynapticNMDAreceptorsinneuronalcalciumsignallingandBDNFgeneregulationJ.CurrOpinNeurobiol,xx,13(3):366-371. 14ShankarGM.NaturaloligomersoftheAlzheimeramyloid-betaproteininducereversiblesynapselossbymodulatinganNMDA-typeglutamatereceptor-dependentsignalingpathwayJ.JNeurosci,xx,27(11):2866-2875. 15LuL.Differentiallong-termneuroadaptationsofglutamatereceptorsinthebasolateralandcentralamygdalaafterwithdrawalfromcocaineself-administrationinratsJ.JNeurochem,xx,94(1):161-168. 16HosoyaK.Blood-brainbarrierproducessignificanteffluxofL-asparticacidbutnot