钩藤碱对痴呆模型小白鼠学习记忆的干预作用研究.doc

钩藤碱对痴呆模型小白鼠学习记忆的干预作用研究 摘要目的研究猫爪草提取物钩藤碱对痴呆模型小白鼠学习记忆的干预作用。方法采用免疫组化分析及半定量反转录聚合酶链反应（reversetranscription-polymerasechainreaction，RT-PCR）测定钩藤碱（rhynchophylline，RH）对快速老化痴呆型小白鼠（SAMP8）脑内位点APP裂解酶（-siteAPPcleavageenzyme，BACE）、-淀粉样蛋白前体（-siteamyloidprecursorprotein，APP）及淀粉样蛋白（amyloid-，A）沉积表达。结果在小鼠探索实验中，SAMP8组小鼠停留原平台象限时间（18.597.72）s，穿越平台次数为（1.000.95）次，而钩藤碱中剂量组两组对应时间分别为（27.028.77）s和（2.301.07）次。与对照组相比，钩藤碱实验组痴呆模型小白鼠在原来的平台各象限中的驻留时间显著变长，且另一方面，该实验组小鼠穿越原来的平台的次数有明显的增加。进一步研究发现钩藤碱各剂量能明显降低SAMP8脑内A平均光密度值和免疫阳性神经元数，如SAMP8组皮层A平均光密度值和免疫阳性神经元细胞数分别为（0.3260.094）和（69.919.31），而钩藤碱中剂量组对应值分别为（0.2420.074）和（39.948.56）。且采用钩藤碱干预后，SAMP8小白鼠脑内BACE、APPmRNA含量也呈现下降趋势，如钩藤碱高剂量组APPmRNA表达值为（84.005.03），与SAMP8组对应值（110.1130.51）。以上效应均呈现一定的量效关系。结论钩藤碱能较好地抑制APP裂解酶、-淀粉样蛋白前体及淀粉样蛋白的过度生成，从而保护小鼠的神经元免受淀粉样蛋白的神经毒性影响，进而改善快速老化痴呆模型小白鼠SAMP8的学习记忆能力。关键词阿尔茨海默病；小鼠；记忆；猫爪草R749.16；R332A1673-9701（xx）06-0012-07InterventionofrhynchophyllineonthelearningandmemoryabilitiesofadementiamousemodelZHUWenjuan1CHENGJinsheng21.DepartmentofPathology，the1stPeoplesHospitalofHuzhouCityinZhejiangProvince，Huzhou313000，China；2.SchoolofMedicine，JiayingUniversity，Meizhou514031，ChinaAbstractObjectiveToresearchtheinterventionofrhynchophyllineextractedfromrootofcatclawbuttercuponthelearningandmemoryabilitiesofadementiamousemodel.MethodsTheexpressionsofbeta-siteAPPcleavingenzyme（BACE），amyloid-precursorprotein（APP）andAinsenescenceaeleratedmouseprone8（SAMP8）mousebrainwerestudiedbyimmunohistochemicalanalysisandreversetranscription-polymerasechainreaction（RT-PCR）analysisetc.ResultsComparingwiththecontrolgroup，inspatialexplorationtestoftheRH-treatedgroup，thestayingtimeandthefrequencyofstridingoverprimaryterracequadrantincreasedsignificantly.Forexample，thestayingtimeoforiginalplatformandfrequencyofcrossingoriginalplatformofSAMP8groupwere（18.597.72）secand（1.000.95）time，respectively.Whileformid-doseofRHgroup，thedatachangedto（27.028.77）secand（2.301.07）time，respectively.TheAmeanopticaldensityaswellasthebrainimmunoreactiveneuronsoftheRHcuredgroupwoulddecreasesignificantlyparingwithSAMP8group.Forexample，forSAMP8group，meanopticaldensityandthebrainimmunoreactiveneuronswere（0.3260.094）and（69.919.31），whileformid-dose，meanopticaldensityandthebrainimmunoreactiveneuronswouldchangeto（0.2420.074）and（39.948.56）.ThemRNAcontentsofBACEandAPPalsodeclineafterrhynchophyllineintervention.Forexample，forhigh-doseRHgoup，theAPPmRNAexpressionwas（84.005.03），whileforSAMP8group，thedatawas（110.1130.51）.Alloftheseeffectsshowedadose-effectrelationship.ConclusionAlltheresultsinthisworkindicatethatrhynchophyllinecanimprovethelearningandmemoryabilitiesinSAMP8byinhibittheexpressionofBACE，APPandAinSAMP8brain，leadingtoprotectionoftheneuronsfromthenuerotoxicityofA.阿尔茨海默氏病（Alzheimersdisease，AD）的临床表现是患者的认知功能和记忆功能越来越差1。典型病理特征为脑部淀粉样蛋白（A）沉积并聚集形成老年斑（senileplaque，SP），且主要存在于与脑部与记忆和认知相关的特定区域2。进一步的研究表明，大量老年斑聚集、淀粉样肽的大量变性沉积以及细胞内蛋白异常磷酸化导致的大量神经原的纤维缠结（neurofibrillarytangles，NFT）其病患脑部的显著病理学特征3，4，这也是AD发病机制中重要的环节之一。诸多证据表明，包括上述A沉积、神经纤维缠结等因素与AD的发病机制密切相关5，6。尽管西方国家已批准9-氨基四氢吖啶及石杉碱甲等药物用于阿尔茨海默氏病的治疗，但治疗效果仍不尽人意，有必要探索包括中草药在内的AD替代治疗方法7。越来越多的临床证据显示，一些中草药对提升轻度至中度阿尔茨海默症患者的学习和记忆能力有很大帮助8，9。钩藤碱是由传统中药钩藤一些药用植物如钓钩藤10（Uncariarhynchophylla，也称鱼钩藤，图1）和绒毛钩藤11（Uncariatomentosa，也称猫爪草）等中提取的一种生物碱，临床应用较多。钩藤碱属于非竞争性拮抗剂和钙离子通道阻断剂12-15。目前，国内外已有中药干扰或治疗阿尔茨海默病相关研究16-21，但尚未见钩藤碱对阿尔茨海默病干扰相关研究。本工作探索通过凝胶电泳和免疫组化方法等技术研究钩藤碱对淀粉样蛋白A聚集体形成及A纤维解聚的体外干预效应。观察钩藤碱对快速老化痴呆模型小白鼠SAMP8的学习记忆能力的改善效果。1资料与方法1.1动物6月龄快速老化痴呆型小白鼠和正常老化小白鼠（SAMR1，雄性）由广州中医药大学第一附属医院提供，SPF级，体重1822g，所有动物实验均符合动物实验伦理准则。1.2试剂一抗：-淀粉样蛋白前体及兔抗大鼠多克隆抗体（购自Invitrogen公司）；二抗：即用型快捷MaxvisionTM检测试剂盒；DAB显色试剂盒购自Invitrogen公司；cDNA逆转录试剂盒和琼脂糖购自上海生工有限公司；焦碳酸二乙酯（DEPC），石杉碱甲，Trizol试剂及PCRTaqMix由GeneTech公司购得；钩藤碱由嘉应学院医学院自制，纯度98.3%，钩藤碱标准品（纯度99%）由中国标准（成都）有限公司提供。1.3伦理声明本工作包含的所有动物实验均符合国际动物伦理准则，并获得学校相关动物伦理委员会的批准（以书名报告的形式获得批准，审批编号为xx0325）。本工作也是在广东省实验动物准则的规范下进行的。所有的实验均努力降低实验动物的使用数量以及它们所承受的痛苦度。1.4实验方法1.4.1分组方法给药及研究试剂6月龄的快速老化痴呆型小白鼠（SAMP8，雄性）50只被随即平均分为SAMP8组、huperzineA（石杉碱甲）阳性对照组、RH（钩藤碱）低、中及高剂量组，共五组。10只6月龄正常老化小白鼠（雄性）设为另一个对照组（SAMR1对照组）。本研究中，快速老化痴呆型小白鼠对照组、正常老化小白鼠对照组喂服生理盐水，剂量为每千克30mL；huperzineA阳性对照组喂服huperzineA每公斤0.02mg；RH低剂量组：喂服钩藤碱剂量：每公斤45mg；RH中剂量组：喂服钩藤碱剂量：每公斤90mg；RH高剂量组：喂服钩藤碱剂量：每公斤180mg；如上各实验组每天以灌胃方式给药一次，连续给药50d。研究时间：xx年5月xx年3月。1.4.2隐蔽性平台实验、探索性实验隐蔽性平台实验：各实验组药物给药结束后，开展水迷宫（Morris）试验。所述水迷宫为一圆形池状结构，不锈钢材质，高度为50cm，直径为100cm，水温为22。该水迷宫共分为四个区域，被成为象限，本实验随即选择任何一个象限，居中放置一个直径10cm的圆形小平台，并将平台沉于水下1cm。上述装置上缘安装有与电脑链接的小型摄像机，并能随时跟踪小鼠的水下轨迹并实时分析。该隐蔽性平台实验共5d，每天两次（上、下午各一次）。小鼠面向池壁，由相邻象限的圆池中间入池。通过摄像机记录小鼠在百秒内寻找到平台的时间。一旦该实验小鼠无法在规定的时间找到平台，将由研究员人工牵引到平台保持约10s。相关数据（逃避潜伏期）被标记为100s。每天记录两次，求平均值。探索性试验：隐蔽性平台实验结束后，将上述平台去掉，将实验小鼠随机放入水中，观察在100s内小鼠回想寻找其记忆中的平台的水中轨迹，并记下其穿越初始平台的次数以及在初始象限中游泳的时间（s）。1.4.3生物化学检测免疫组化实验：上述实验结束后，将实验小鼠处死，在低温情况下快速取出实验小鼠的脑部组织，置于超低温冰箱中保存。每次对上述组织进行切片分析前，一次将其放入低温冰箱和4冰箱各30min，随后用10%的福尔马林处理。经相关处理（包括脱水、浸蜡、包埋等）后，切为3m左右切片，并选用二甲苯进行脱蜡，并用酒精梯队水化处理。淀粉样蛋白在柠檬酸缓冲溶液（pH值为6.0）修复抗原约90s（在压力容器内加热至沸腾）。各切片滴加1滴上述溶液或者H2O2溶液（3%，50L），在室温下静置10min。从而对活性内源性过氧化物酶进行有效阻断。各切片加50L的-淀粉样蛋白前体和按1100稀释的淀粉样兔抗大鼠多克隆抗体，在常温冰箱保温层静置过夜。上述各切片采用50L的二抗（MaxvisionTM试剂盒）室温静置15min。二氨基联苯胺显色，在显微镜下观察以控制时间。通过蒸馏水或去离子水及时洗涤以结束上述反应。采用Hematoxylin（苏木素）复染30s，水洗涤、返蓝处理、乙醇梯度脱水处理、二甲苯脱蜡处理、树胶（中性）封片处理等，在显微镜下观察。上述切片经二氨基联苯胺显色处理后，淀粉样蛋白及-淀粉样蛋白前体显黄色。采用磷酸缓冲液替代一抗（primaryantibody），以作为实验的阴性对照。在-淀粉样蛋白前体等染色切片的小鼠脑部皮层以及海马区域各取三个视野，采用病理切片分析系统分析各视野范围内-淀粉样蛋白前体及淀粉样蛋白的光密度均值以及具有阳性的细胞数目。1.4.4采用逆转录PCR测定BACE和APPmRNA按Trizol试剂说明提取细胞总RNA，并检测RNA完整性和纯度，利用cDNA逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA。依据美国国家生物技术信息中心信息银行的小鼠脑内位点APP裂解酶（BACE）、-淀粉样蛋白前体（APP）及淀粉样蛋白（A）的序列，以Primerpremier5.0软件（加拿大Premier公司）来设计各蛋白上下游的引物相应序列。BACE上游引物为5-TGGGCTTCTGTCTTGGAG-3，下游引物为5-TATGCGATGCGAATGTTT-3；APP上游引物为5-AGATTGCGATCGCGTACTCT-3，下游引物为5-GATTTGATCGGCGATTATTG-3；-actin上游引物为5-TAGCGCCCGTTGGTTGTCGT-3，下游引物为5-TTGACGCCTGATAGCTGCAGCC-3，以上引物由上海生工生物工程公司合成。本工作利用上述设计的引物及PCR试剂盒各自合成位点APP裂解酶（BACE）、-淀粉样蛋白前体（APP）及淀粉样蛋白（A）等基因。扩增反应条件：93预变性5min，随后同样温度变性42s。55退火50s，70保持1min。共3236个循环。72继续延伸10min。随后，吸取10L扩增产物于凝胶电泳（含溴酚蓝），参数设置为100福特，持续45min。凝胶电泳完成红，采用Bio-Rad凝胶成像分析仪进行观察。并对PCR扩增后的片段的光密度进行扫描，得出相应的光密度积分值。此外，扫描相同产品的靶基因PCR扩增产物及内参的PCR扩增物的光密度，得出光密度比值一分析靶基因的表达水平。1.4.5钩藤碱的制备、纯化钓钩藤等样品采自梅州阴那山，样品采集后经晒干、切段，粉碎及过筛（40目，59.6pm）等工序进行预处理。取1个100mL烧杯，加入50mL80%乙醇，将样品（10g）浸泡其中，并在-4冰箱静置12h。随后将样品溶液超声1h，旋转蒸发除去溶剂，收集棕色残留物。将该棕