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石棉暴露下内质网应激在肺泡上皮细胞凋亡中的作用机制 周煦刘刚 广东医学院广东湛江524023 通讯作者：刘刚 基金项目：国家自然科学基金（编号：81172615），广东省自然科学基金（编号：Sxx010008299），广东医学院青年基金项目（编号：Qxx016） 【摘要】目的探讨石棉暴露下内质网应激在细胞凋亡中的作用机制。方法应用石棉处理A549细胞，免疫荧光染色免疫法和免疫印迹法观察内质网应激（ERS）相关蛋白与促凋亡基因的变化。结果石棉暴露下，ERS相关蛋白Bip、IRE?1和GRP94，以及促凋亡基因BAX、BAK蛋白表达均上调，且与石棉暴露时间呈正相关。结论内质网应激参与了石棉诱导的细胞凋亡。 【关键词】石棉内质网应激凋亡 内质网是细胞内重要的细胞器，内质网功能的损伤可引起内质网应激（EndoplasmicReticulumStress，ERS），长期过强的内质网应激诱导内质网相关性细胞凋亡。此前的研究提示线粒体调控的细胞凋亡是石棉引起细胞凋亡的主要途径1，ERS介导的细胞凋亡是近年新发现的凋亡途径，近年ERS所启动的凋亡途径以其独特的地位受到越来越多的关注。由于肺泡上皮细胞(AlveolarEpithelialCell，AEC)的凋亡代表了一个慢性肺间质纤维化的早期活动，而石棉肺早期的病理变化类似于特发性肺间质纤维化（IdiopathicPulmonaryFibrosis,IPF）2-3，因此我们以AEC作为研究对象探讨石棉引起AEC凋亡的具体机制。 1材料与方法 1.1材料 人肺腺癌上皮细胞株A549购于AmericanTypeCultureCollection（ATCC）。DMEM、FBS（GIBCOInvitroge公司）；BIP，IRE?1，GRP94，BAK，BAX抗体（CellSignalingTechnology公司）；?actin（SantaCruz公司）。 1.2仪器 激光共聚焦显微镜系统TCSSP5II（Leica公司）；荧光成像系统VersaDocMP5000（Bio?Rad公司）；生物培养箱Thermofisher144L（Thermo公司）；高速离心机Minispin（Eppendorf公司）；电热恒温水箱CU420（Julabo公司）。 1.3方法 1.3.1细胞培养常规DMEM培养基（含10%胎牛血清）培养。 1.3.2石棉处理采用不锈钢剪刀将石棉（产于青海芒崖）纤维状矿物材料剪碎，PBS配成5mg/ml浓度的悬浊液，经超声分散与充分振荡混匀，高压蒸汽灭菌后备用。石棉纤维的分散度大约70%为可吸入（25m）。 1.3.3免疫荧光染色甲醛固定细胞，利用Triton?X?100使部分膜蛋白变性，羊血清封闭，一抗孵育过夜，次日冲洗三次，每次10min，加入二抗，2h后冲洗，加入抗荧光淬灭剂后封片，激光共聚焦显微镜观察、
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