GB-T5009.171-2003保健食品中超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定.pdf

I CS 6 7C 5 3 0 4 0中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准G S / T 5 0 0 9 . 1 7 1 -2 0 0 3保健食品中超氧化物歧化酶( S O D ) 活性的测定D e t e r mi n a t i o n o f t h e a c t i o n o f s u p e r o x i d e d i s mu t a s e i n h e a l t h f o o d s2 0 0 3 - 0 8 - 1 1 发布2 0 0 4 - 0 1 - 0 1实施华 人 民 共 和 国 卫 生 部、 -Y T，云 j 走巴 才二产吧 、 浮扮 1， 产吮 产 广丫 1】 共 翻 e rJJ 叭 心 减 ，I J但 医 曰MI 勿 r - ,n F 巨 1 毛了 r 里 2 z 少 吸乞 牙中中免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载G B / T 5 0 0 9 . 1 7 1 -2 0 0 3o il吕本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准负责起草单位： 吉林市卫生防疫站、 吉林医学院。本标准第一法主要起草人 ： 袁彦华、 罗速、 于敬伟、 孙连军、 赵凤明。本标准第二法主要起草人 ： 罗速、 袁彦华、 张吉林、 卢忠魁。免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载G B / T 5 0 0 9 . 1 7 1 -2 0 0 3引宣 二 刁 超氧化自由基 ( ) 可以造成机体细胞损伤。超氧化歧化酶( S O D ） 能够清除机体内 O z 。食品中S O D活性的测定， 国内外尚无标准检验法。因此， 卫生部九五制标规划确定了食品中 S O D活性测定的研究课题 。 本标准以修改的 Ma r k l u n d 方法和化学发光法测定食品中S O D活性。前者 S O D活性测定最低检出浓度为 1 . 1 7 U / m L ， 相当于 l . 1 X 1 0 co o l / 1 , ， 方法灵敏， 仪器价廉 ， 操作简单， 易于推广； 后者 S O D活性测定最低检出浓度为 0 . 0 3 3 U / ml ， 相当于 3 . 0 X 1 0 10 m o l / L ， 灵敏度比前者提高约二个数量级。具有更加灵敏、 快速和干扰少等优点， 但试剂较贵， 可应用于仲裁或科研。两种测定方法对同一 S O D酶测定结果无显著差异( P 0 . 0 5 ) 0免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载GB / T 5 0 0 9 . 1 7 1 - 2 0 0 3保健食品中超氧化物歧化酶( S O D ) 活性的测定范围本标准规定了食品中超氧化物歧化酶( S O D ) 活性的测定方法。本标准适用于各类食品中超氧化物歧化酶( S O N ) ） 活性的测定。本方法第一法检出限 1 . 1 7 U / ml ； 第二法检出限 0 . 0 3 3 U ,/ M l , .第一法修改的Ma r k l u n d方法定义2 5 时抑制邻苯三酚 自氧化速率 5 0 时所需的 S O D量为一个活力单位 。原 理在碱性条件下， 邻苯三酚会发生 自 氧化， 可根据 S O D抑制邻苯三酚自氧化能力测定 S O D活力。4试 剂4 . 1 A液： p H 8 . 2 0 0 . 1 m o l/ 1 , = . 经甲基氨基甲烷（ T r is ) -盐酸缓冲溶液（ 内含 1 m m o l/ L E D T A 2 N a ) o称取 1 . 2 1 1 4 g T r is 和 3 7 . 2 m g E D T A 2 N a 溶于 6 2 . 4 m l , 0 . 1 m o l / I 盐酸溶液中， 用蒸馏水定容至1 0 0 ml _4 . 2 B液： 4 . 5 m m o l/ I邻苯三酚盐酸溶液。称取邻苯二酚( A . R ) 5 6 . 7 m g 溶于少量 1 0 m m o l / I盐酸溶液， 并定容至 1 0 0 ml 。4 . 3 1 0 mmo l / I盐酸溶液 。4 . 4 0 . 2 0 0 m g / m l 、 超氧化歧化酶( S O D ) o4 . 5 蒸馏水： 二重石英蒸馏水。5 仪器5 . 1 紫外一 可见分光光度计。5 . 2 精密酸度计， 精确度 0 . 0 1 p H.5 . 3 离心机 。5 . 4 1 0 ml比色管。5 . 5 1 0 ml - 离心管。5 . 6 玻璃乳钵。6 试样的制备6 . 1 固体样品（ 茶、 花粉等） 称取 1 . 0 0 g 样品置 于 玻璃乳钵中， 加入 9 . 0 m L蒸馏水研磨 5 m in ， 移人1 0 m L 离心管。用少量蒸馏水冲洗乳钵， 洗涤并人离心管中， 加蒸馏水至刻度， 经 4 0 0 0 r / m i n 离心1 5 m i n ， 取 上 清液测定。6 . 2 澄清液体样品可取原液直接测定， 浑浊液体样品经 4 0 0 0 r / m i n 离心 1 5 m i n ， 再取上清液测定。免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载G B / T 5 0 0 9 . 1 7 1 -2 0 0 37 分析步骤7 . 1 邻苯三酚自 氧化速率测定在 2 5 左右， 于 1 0 r il l ， 比色管中依次加人 八液 2 . 3 5 m L , 蒸馏水2 . 0 0 m l B 液 。1 5 m 1 . 。加入 B 液立即混合并倾人比色皿， 分别测定在 3 2 5 n n 、 波长条件下初始时和l m i n 后吸光值， 二者之差即邻苯三酚自 氧化速率 A , 2 5 ( m i n - ) 。本试验确定 D A 3 s s ( m i n ） 为0 . 0 6 0 07 . 2 样液和 S 0 1) 酶液抑制邻苯三酚自 氧化速率测定按 7 . 1 步骤分别加人一定量样液或酶液使抑制邻苯三酚自 氧化速率约为1 / 2 A A 3 2 5 ( m i n - ) ， 即 A 1 2, ( m i n - ） 为0 . 0 3 0 0 S O D活性测定加样程序见表 t oS O D活性测定加样表 试液 n液/ M L 蒸馏水 M I .样液或S O D液 p 1 , 1 3 液 t i l l ,表 1空2 3 52 0 00 . 1 52 3 51 . 8 020 . 0. 1 55 （ ） D液 2 3 5 1 8 0 2 o . o 0 . 1 58 结果结果计算 液体样品按式（ 1 ) 计算： S OD活力（ U/ 1 11 1 ）式 ！ ， ：U / m L - - S O ） D酶活力单位；A A 32 5 邻苯二酚自氧化速率；D A、 一 A 。 ：， 、 一三 入 I U U 为 八 7 7 ,一工 声 不 厂 不 ， 一 一 一一入 住 0 U 7a： X 奥； U 。 （ ： V 八 / 3Z 。一 样液或 S O D酶液抑制邻苯二酚自 氧化速率； V 一所加酶液或样液体积， 一单位为毫升（ fi l l , ) ; I )酶液或样液的稀释倍数； 4 . 5反应液总休积， 单位为毫升（ M I ） 。计 算结果保留二位有效数字。2 固体样品按式（t 2 ） 计算： 八 腿 、 一 八。、 ， 、 了二， ， ， ，、D Ay刀 ，f ib/ 1t U/ g） 一万 n, V 70X 1 0 0 ，t 夕V一一一入 4.为入 ；X V7 ) I（2） 式中： V 加人酶液或样液体积， 单位为毫升（ r ri I ） ；A A , -,邻苯止酚自氧化速率； 八 ：二 。一 样液或 S O D酶液抑制邻苯气酚自 氧化速率； D -酶液或样液的稀释倍数； V , 样液总体积， 单位为毫升（ TT I I ） ： 。 ； 一样品质量， 单 位为克（ 9 ） ； 4 . 5 一反应液总体积， 单位为毫升（ m L ) o 计算结果保留三位有效数字。8 . 2 精密度 在重复性条件下获得的两次独 立 测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 1 0 %0免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载G B / T 5 0 0 9 . 1 7 1 -2 0 0 3第二法化学发光法9定 义在分析条件下抑制 5 0 发光强度时所需 的 S OD量为一个活力单位 。1 0 原理 S O D能够催化下述反应： 。 ： 一 （ ）、 一 2 H 一 塑 H 3 0 , + 0 3 在有氧条件下， 黄嗓岭氧化酶可催化黄嗦岭（ 或次黄嗦吟） 氧化转变成尿酸， 在该反应过程中同时产生 0 2 0 0 一可与鲁米诺（ 3 - 氨基邻苯二甲酞麟） 进一步作用， 使发光剂鲁米诺被激发， 而当其重新回到基态时， 则向外发光。由于 S O D可消除 0 2 一 ， 所以能抑制鲁米诺的发光。通过该反应过程， 以空白对照的发光强度值为 1 0 0 0 o ， 通过加人 S O D后抑制发光的程度进行 S O D活性的测定。1 1 试剂1 1 . 1 0 . 0 5 m o l/ I _ 碳酸盐缓冲液（ p H 1 0 . 2 )1 1 . 1 . 1 0 . 1 m o l / I 碳酸钠（ N a z C 0 3 ） 溶液称取碳酸钠（ A. R ) 1 0 . 5 9 9 g 用蒸馏水溶解并定容至1 0 0 0 m i l .1 1 . 1 . 2 0 . 1 m o l/ L 碳酸氢钠（ N a H C 0 3 ) 溶液称取碳酸氢钠（ A . R ) 8 . 4 0 1 g 用蒸馏水溶解并定容至1 0 0 0 ml -1 1 . 1 . 3 0 . 1 m o l / I , 碳酸钠一 碳酸氢钠缓冲液（ p H 1 0 . 2 ） 将 0 . 1 m o l / L碳酸钠（ N a z C 0 3 ) 溶液和0 . 1 m o l / I _ 碳酸氢钠（ N a HC 0 3 ） 溶液按 6 十4比例混合。1 1 . 1 . 4 0 . 0 5 m o l/ l . 碳酸钠一 碳酸氢钠缓冲液（( p H 1 0 . 2 ) 0 . 1 m o l / L p H 1 0 . 2 碳酸钠一 碳酸氢钠缓冲液（ 1 1 . 1 . 3 ） 与蒸馏水按 1 +1 比例混合。1 1 . 2 0 . 0 5 m o l / I . 碳酸钠一 碳酸氢钠（ 内含0 . 1 m m o l / l . E D T A 2 N a ） 缓冲液（ p H1 0 . 2 ） 称取3 7 . 2 m gE D T A 2 N a 用 0 . 0 5 m o l / L 碳酸钠一 碳酸氢钠 p H 1 0 . 2 缓冲液（ 1 1 . 1 . 4 ) 溶解并定容至 1 0 0 0 m l 。1 1 . 3 0 . 1 m m o l / l . 鲁米诺溶液（( 1 - u m i n o l ) 称取 3 . 5 4 m g 鲁米诺用蒸馏水溶解并定容至 2 0 0 ML .1 1 . 4 0 . 1 m m o l / I ， 次黄嗦吟溶液（ l H X ） 称取 2 . 7 6 m g H X用蒸馏水溶解并定容至 2 0 0 m l , .1 1 . 5 0 . 1 m m o l/ I ， 黄嚓吟氧化酶( X O ) 0 . 1 m g X ( ） 用含 0 . 1 m m o l / I , E D T A 2 N a 的 0 . 0 5 m o l / I碳酸盐缓冲液（ 1 1 . 2 ) 定容至 1 . 0 ml 。1 1 . 6 0 . 0 0 1 m g / m l , 超氧化物歧化酶( S O D ） 精密称取 0 . 1 m g S O D用含 0 . 1 m m o l / I , E D T A 2 N a的 0 . 0 5 m o l / I , 碳酸盐缓冲液（ 1 1 . 2 ） 定容至 1 0 0 m l 。1 1 . 7 H X - I液0 . 1 m m o l / 1 , H X溶液与 0 . 1 m m o l / l , 鲁米诺溶液 1 +1 ( V / V ） 混合（ 临用时混合） 。1 2仪 器生物化学发光仪。1 3 试样的制备 按第一法中第 6章规定 的方法操 作。只是 固体样 品用 0 . 0 5 m o l/ I碳酸钠一 碳 酸氢钠 （ 内含0 . 1 m m o l / l , E D T A 2 N a ） 缓冲液（ 1 1 . 2 ） 代替蒸馏水。1 41 4分析步骤 绘制抑制发光 曲线操作程序见表 2 和图免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载G B / T 5 0 0 9 . 1 7 1 -2 0 0 3八UnonnOOnhJ任Q白1次瓣长绷露早12 4 6 ll8 1 0 S O D / ( n g / m L ) 图 1 S O D抑制化学发光曲线表 2 S O D抑制化学发光曲线 制作步骤10980阳101黝10810姗功6l卿1040 . 0 5 i i i u l / I 碳酸钠一 碳酸氢钠缓冲液（ ） 川0 . 2 ) / 川0 . 1 mg/ml- X O / u I1 -i X - I液/ I I I不同浓度 S O D( 或 试液、 川S O D浓度 （ n g / r il l ） 或（ 样液休积加I ）相对光强未抑制 抑制厂 0(XIM) 110 -10 10980 980_ 101 4 . 2 测定 S O D活性 测定样品相对发光强度， 计算抑制发光率， 并查 S O D抑制发光曲线， 得 S O D量( n 妇1 5 结果1 5 . 1 结果计算1 5 . 1 . 1 液休样品按式（ 1 ) 计算：S O D活力（ U/ ml ）二r n 上 x1 0s x3 VX 5火3 3 0 0、 ， 、一 入t 少（ 1 ） 式 中 ： r n , 一 一 查抑制曲线中 S O D量， 单位为纳克（ n g ) ; V 一 一 取样液体积， 单 位为毫升（ m l ） ； 3 . 5 一 标准 S O D抑制 5 0 发光时的 S O ） D浓度， 单位为纳克每毫升（ n g / m l ） ； 3 3 0 0 一一S O h ） 标准比活力 J / m g 蛋I ； 。S O T ) 酶液抑制 5 0 化学发光率时