GB-T5009.189-2003银耳中米酵菌酸的测定.pdf

I C S 6 7 . 0 4 0C 5 3中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准G B / T 5 0 0 9 . 1 8 9 -2 0 0 3 部分代替 G 1 3 1 1 6 7 5 - - 1 9 8 9银耳中米酵菌酸的测定D e t e r mi n a t i o n o f b o n g k r e k i c a c i d i n t r e m e l l a f u c i f o r mi s b e r k2 0 0 3 - 0 8 - 1 1 发布2 0 0 4 - 0 1 - 0 1 实施中 华 少 味民 共 和 国 卫 生 部，中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会 免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载G B / T 5 0 0 9 . 1 8 9 - 2 0 0 3前 曰 J 曰本标准代替G B 1 1 6 7 5 -1 9 8 9 银耳卫生标准 中5 . 1 米酵菌酸的测定。本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。本标准由河南省食品卫生监督检验所、 河南省南阳地区卫生防疫站负责起草。本标准主要起草人 ： 任中善、 马军、 赵国庆、 张丁、 韦喜亭 。标准下载网()免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载G B / T 5 0 0 9 . 1 8 9 - 2 0 0 3引言 米酵菌酸 b o n g k r e k ic a c id ( B A ) ， 即酵米面黄杆菌毒素 A ( f l a v o t o x i n A) 是由椰 毒假单胞 菌( p s e u d o m a n a s c o c o v e n e n a n s ） 产生的一种1 if 以引起食物中毒的毒素。系统命名为： 3 - 梭甲基- 1 7 一 甲氧基6 , 1 8 , 2 1 - =甲基一 廿 二碳- 2 , 4 , 8 , 1 2 , 1 4 , 1 8 , 2 0 一 七烯二酸。标准下载网()免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载G B / T 5 0 0 9 . 1 8 9 -2 0 0 3银耳中米酵菌酸的测定范 围本标准规定了银耳中米酵菌酸的测定方法。本标准适用 于银耳 中米酵菌酸 的测 定。薄层色谱测定法原理 试样中的米酵菌酸经提取、 净化及浓缩后 ， 根据其在短波紫外光 G F 2 ; ； 硅胶薄层色谱上显示黑色点的最低检 出量测定含量 。仪器3 . 1 层析槽（ 内径长X宽X高， 2 5 c mX6 c mX 4 c m) .3 . 2 G F , ; , 硅胶薄层 5 0 m m X 2 0 0 m m X 0 . 3 mm ) ， 自制， 经 1 1 0 0C -1 1 5 活化 2 h -3 h ， 置干燥器中可保存一周 。3 . 3 紫外线灯（ 波长 2 5 4 r im) o3 . 4 紫外分光光度计。试剂 本标准所用的试剂除特殊规定外， 均为分析纯 ， 水为蒸馏水或同等纯度的水， 溶液为水溶液。4 . 1 硅胶： G F Z , ； 层析用。4 . 2 薄层色谱展开剂： 石油醚一 无水乙醚一 冰乙酸 6 0 +4 0 +1 . 5 04 . 3 米酵菌酸标准溶液： 称取米酵菌酸标准品， 用甲醇配制成每毫升含有米酵菌酸 2 0 r g 供测定用 ， 置于 4 冰箱中避光保存。4 . 4 甲醇。4 . 5 冰乙酸。4 . 6 石油醚， 沸程 3 0 0C - 6 0 0C o4 . 7 无水乙醚。4 . 8 三氯甲烷。4 . 9 8 5 g / 1 0 0 m l . 磷酸。4 . 1 0 4 0 g / I碳酸氢钠水溶液。4 . 1 1 6 mo l / l . 盐酸 。分析步骤5 . 1 米酵菌酸的提取 干银耳试样经粉碎过 4 0目筛后， 称取 2 0 g ， 置具塞锥形瓶中， 加人甲醇 2 0 m l ， 于室温中避光浸泡1 h ， 然后再加人蕊氯甲烷 8 0 m l和 8 5 g / 1 0 0 m l 磷酸 0 . 2 m l- ， 鲜银耳试样经剪碎、 磨细及混匀后称取1 0 g ， 加人甲醇 1 6 ml , 于室温中避光浸泡 1h ， 然后再加人三氯 甲烷 6 4 m l , 和 8 5 g / 1 0 0 m l , 的磷酸0 . 1 6 mI ； 振荡 3 0 mi n ， 过滤 ， 干银耳取滤液 5 0 mI . ， 鲜银 耳取滤液 4 0 mL o标准下载网()免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载G B / T 5 0 0 9 . 1 8 9 -2 0 0 3 将以上滤液移人分液漏斗中， 加人与滤液体积相同的碳酸氢钠水溶液， 振摇 2 ra i n ， 静置分层， 用带自 动控制球吸管吸出 ！ 几 层于另分液漏斗， ， ， 再用碳酸氢钠水溶液重复提取两次， 每次 1 0 m l - ， 轻摇， 静置， 将二次碳酸氢钠水层合并， 加人只氯甲烷 2 5 m l ， 振摇 2 m i n ， 静置分层后弃去只氯甲烷层， 于分液漏斗中慢慢滴人 6 m o l / I 盐酸以调该溶液 p 1 -1 至 2 -3 ， 加人石油醚（ 沸程 3 0 0C 一 6 0 C) 5 0 n i l （ 鲜银耳试样加 4 0 m L ) ， 振摇 3 m i n ， 静置分层， 取出石油醚层于梨形瓶中， 再重复用石油醚 3 0 m1 . 和 2 0 m L各提取 一 次（ 鲜银耳试样两次均为 2 0 m l . ) ， 将石油醚层并人同一瓶中， 于 4 0 水浴中减压吹气浓缩至干， 用甲醇移至带 1 n i l刻度的浓缩管中， 丁 飞 4 0 用减压法浓缩至 0 . 2 ml一 以下， 并用少许甲醇洗管壁， 继续浓缩至十， 加甲醇0 . 1 2 5 m l . ， 将干物质溶解， 混匀， 作为样液以供薄层色谱测定用。5 . 2 薄层色谱测定 以薄层板的短边为底边， 距底边3 c m的基线上用微量注射器滴加2 0 u 川m I 标准液8 川泌 与1 0 p 1 _两个点， 以及样液两个点， 每点 1 0 川 （ 鲜银耳试样滴加 2 0 川. ) , 在样液的一个点 上 再滴加 2 0 fA g / mI. 标准液 1 0川 。用展开剂展开 1 6 c m， 取出挥 千。在 2 5 4 n m紫外灯光下观察结果如下： a ） 标准点应出现黑色点； b ） 如样液点在标准点相应位贵 卜 未出现黑色点 ， 则试样中米酵菌酸的含量在测定方法灵敏度 0 . 2 5 t cg / g 以下； 如在相应位置上有黑色点， 而另一点中样液与标准液点重叠， 则为阳性， 根据 样液黑点的强度估计减少滴加微升数， 或经稀释后再滴人不同微升数， 直至样液与标准色点 的强度与面积一致为止米酵菌酸的比移值为 0 . 2 2 05 . 3 结果计算 见式（ 1 ) 。X - - 0X D X 工 ” ” ” （l） 式扫 X 一 一 米酵菌酸含量， 单位为微克每克（ Ix g / g ) ; 0 . 2 米酵菌酸的最低检出量， 单位为微克（ f-t g ) ; V , . 一 加人甲醇溶解的体积， 单位为毫升（ mL ) ; v ： 一 一出现最低检出量时滴加样液的体积 ， 单位为毫升（ M L ) ; 0 样液的总稀释倍数； 甲醇溶解时相当试样的质里一 单位为克（ g ) a5 . 4 确证试验 对含量高的试样可以进 一 步作确证试验； 将剩余的阳性样液 与 空自甲醇液分别经薄层分离后， 刮下并收集与米酵菌酸标准相应的色谱带与空白处硅胶。各加甲醇 4 m L , 于室温中浸泡 1 h -2 h , 混匀， 离心， 吸出上清液， 以空自硅胶甲醇洗脱液作对照， 用紫外分光光度计测定， 应在 2 6 7 n m和 2 3 6 n m处有米酵菌酸的两个最高吸收峰。高压 液相 色谱测 定 法6 原 理试样中的米酵菌酸经提取、 净化及浓缩后， 根据在高压液相色t4 土的出峰面积测定含量。7 试剂7 . 2高压液相色谱洗脱剂： 甲醇一 水 冰乙酸仁 7 5 +2 7 +1 . 7 ， 在配制前， 所用试剂及水均需分别重蒸馏。其他试剂同 4 . 3 , 4 . 4 , 4 . 5 , 4 . 6 , 4 . 7 , 4 . 8 , 4 . 9 , 4 . 1 0 , 4 . l l o标准下载网()免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载GB / T 5 0 0 9 . 1 8 9 -2 0 0 38 仪器8 . 18. 28. 38 . 48 . 58 . 6高压液相色谱仪。2 0 u L 试样环。紫外检测器， 调波长至 2 6 7 r i m,积分仪 。 。预柱 4 . 6 m m( I D ) X5 c m， 内装 L 1 a 硅胶， 粒度直径为 1 0 p cma分析柱 A lt e x U l t r a s p h e r e T M - O D S , 粒度直径为 5 t1 m, 4 . 6 m m ( I D ) X2 5 c m o9 分析步骤9 . 1 米酵菌酸的提取 同5 . 1 1 但最后不用甲醇转移， 直接于瓶内加入甲醇 0 . 5 m I . ， 将干物质溶解 ， 混匀， 取出上清液经离心后， 置小试管中， 作为样液供高压液相色谱测定用。9 . 2 高压液相色谱测定 高压液相色谱操作条件 ： 流速 1 . 1 m l . / m i n ， 纸速 0 . 5 c m / m i n ， 检定器灵敏度为将 1 0 fj.g / m I-标准液 2 0 p l ， 调至满刻度的 7 0 %-9 0 %。在做高压液相色谱时， 首先用洗脱液平衡分析柱， 从进样 口装置分别进人不同浓度的标准液与样液各 2 0川一 。在米酵菌酸标准峰面积的直线范围内， 将样液与标准的峰面积相比以求出试样中米酵菌酸的含量。米酵菌酸的保留时间为 1 7 m i n ,9 3 结果计算 见式（ 2 ) 0 A入一X万 八 2X V X D X 生（2 ） 式 中 ： X 一 米酵菌酸的含量， 单位为微克每克（ 拼 9 9 ） ； 一 米酵菌酸标准溶液的浓度， 单位为微克每毫升（ tx g / m l .