GB-T5009.158-2003蔬菜中维生素K1的测定.pdf

I CS 6 7 . 0 4 0C 5 3中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准G B / T 5 0 0 9 . 1 5 8 -2 0 0 3蔬菜中维生素 Kl 的测定D e t e r mi n a t i o n o f v i t a mi n K, i n v e g e t a b l e s2 0 0 3 - 0 8 - 1 1 发布2 0 0 4 - 0 1 - 0 1 实施中 华 人 民 共 和 国 卫 生 部中 国 国家 标 准 化 管 理 委 员会认 一免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载G B / T 5 0 0 9 . 1 5 8 -2 0 0 3前 J 曰 本标准对应于 A O A C . 4 5 维生素和营养素部分食物中维生素 D的测定（ 1 9 9 5 年英文版） ， 本标准与A O A C . 4 5 的一致性程度为非等效。 本标准由中华人民共和国卫生部提出并归口。 本标准起草单位 ： 中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所。 本标准主要起草人 ： 王竹、 王光亚、 周瑞华 、 王国栋、 杨月欣。标准下载网()免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载G B / T 5 0 0 9 . 1 5 8 -2 0 0 3己I套 J I p a 本标准参考 A O A C . 4 5 维生素和营养素部分食物中维生素 D的测定（ 1 9 9 5 年版） 的前处理过程， 以磷酸盐处理过的氧化铝为色谱柱， 应用高效液相色谱反相柱对蔬菜中维生素 K ， 进行定性及定量分析 。标准下载网()免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载G B / T 5 0 0 9 . 1 5 8 -2 0 0 3蔬菜中维生素 K , 的测定范围本标准规定了蔬菜中维生素 K , 的测定方法。本标准适用于各类蔬菜、 绿色植物及其干制品中维生素 K , 的测定。本标准方法出限为 0 . 5 f i g ， 线性范围为 1 tl g / m L - 1 0 0 f c g / m I _2原 理 蔬菜中的维生素 K ， 经石油醚提取后， 注人经磷酸盐处理的氧化铝色谱柱中进行色谱分离， 除二千扰物。收集含维生素 K ， 的淋洗液流分， 浓缩定容后注人高效液相色谱柱， 用紫外检测器， 在 2 4 8 n n ， 处测定。以外标法计算试样中维生素 K ： 的含量。试 剂和材 料 色谱用水和有机溶剂使用前均需重新蒸馏。3 . 1 无水硫酸钠 ： 使用前需在 1 5 0 的烘箱内烘烤 4 h -8 h ， 以去除水分。3 . 2 0 . 1 4 m o l/ I硫酸钠溶液： 称取 2 0 g 无水硫酸钠， 用蒸馏水溶解后定容至 1 1 -3 . 3 . 3 丙酮。3 . 4 石油醚： 沸程 3 0 0C -6 0 0C o3 . 5 乙醚： 不含过氧化物。3 . 5 . 1 过氧化物的检查方法 ： 用 5 m l - 乙醚加 I m l . 0 . 6 m o l / I . 碘化钾溶液， 振摇 1 m i n ， 如有过氧化物则放出游离碘， 水层呈黄色。或加 4 滴 5 g / 1 , 淀粉液， 水层呈蓝色。则该乙醚含有过氧化物需处理后使用 。3 . 5 . 2 去除过氧化物的方法： 重蒸时瓶中加一段纯铁丝， 弃去首尾 1 0 部分， 收集馏出的乙醚。再检查过氧化物， 应符合要求。3 . 6 洗脱液： 石油醚丰乙醚( 9 7 +3 ) o3 . 7 甲醇： 优级纯。3 . 8 正己烷： 优级纯。3 . 9 中性氧化铝： 层析用， 1 0 。目一2 0 0目。3 . 9 . 1 氧化铝的处理 ： 取 2 5 0 g 中性氧化铝, 2 0 g 磷酸氢二钠， 1 . 6 L水， 放入容积为 21的锥形瓶中，置于沸水浴 3 0 m i n ， 不时摇动。冷却， 倒掉上层液体（ 包括悬浮的细小颗粒） ， 然后用布氏漏斗抽滤。将残留物转至平底玻璃皿中， 于 1 5 0 0C 千燥箱中烘烤 3h -5 h至两次称量相差 3 g以下。烘烤过程中不时搅拌， 以避免结块 ， 冷却后放人干燥器中保存。3 . 9 . 2 失活： 将磷酸盐处理的氧化铝( 3 . 9 . 1 ) ， 加人具塞锥形瓶中。按每 1 0 0 g 氧化铝加 9 . 0 ml, 水的比例加人去离子水， 盖紧瓶塞， 蒸汽浴或 8 0 干燥箱加热 3 m in - 5 m i n ， 剧烈摇动锥形瓶， 使氧化铝可以自由流动， 无结块。冷却， 静置 3 0 m i n ， 使水分分布均匀。3 . 9 . 3 氧化铝的检验 ： 取标准使用液 1 . 0 M I ， 用氮气（ 3 . 1 1 ) 吹千， 再 用石油醚( 3 . 4 ) 溶解定容至1 . 0 m L 。 然后按 5 . 2 . 2 . 1 装柱， 将标准溶液加人柱t . ， 按 5 . 2 . 2 . 2 色谱分离步骤进行柱色谱， 用旋转蒸发瓶（ 4 . 5 . 1 ） 收集含有维生素 K ； 的洗脱馏分 ， 浓缩， 氮气吹干， 用正己烷（ 3 . 8 ) 定容至 1 . 0 n i l 进样，H P L C测定， 记录峰面积或峰高（ A ) o另取标准应用液直接测定， 记录峰面积或峰高（ A , ) 。 将 A 与 A ,进行比较， 其值在 0 . 9 7 -1 . 0 3 之间（ A / A , ) ， 说明柱效较好， 氧化铝处理合格。否则需重新进行失活处标准下载网()免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载G B / T 5 0 0 9 . 1 5 8 -2 0 0 3理。如果再次验证比值仍不能达到 0 . 9 7 ， 则需重新制备氧化铝。3 . 1 0 维生素 K , （ 纯度） 9 8 Y o ） 标准溶液。3 . 1 0 . 1 维生素 K 、 标准储备液： 准确称取 5 0 . 0 m g 维生素 K ， 纯品， 于5 0 m I棕色容量瓶中， 用正己烷溶解并稀释定容至刻度， 即储备液浓度为 ！ . 0 m g / m l . 。将储备液分装成安瓶， 冷冻保存。3 . 1 0 . 2 维生素 K ， 标准使用液： 准确吸取维生素 K ， 标准储备液（ 3 . 1 0 , 1 ) ， 用正己烷按 1 c 5 0 比例雕确稀释， 即该维生素K ： 标准工作液浓度为2 0 t-t g / m l 。3 . 1 0 . 3 标准使用液的标定： 取维生素 K ， 标准使用液， 于波长 2 4 8 n m处， 测定紫外吸光度值， 比色杯厚度 1 c m ， 以正己烷为空自， 测定 3 次， 取平均值， 按式（ ”计 一算标准工作液浓度。、 一 _A1 ） rn 、 、二“ “ ， ， 。 （1） 式 中： X 一维生素 K ， 标准使用液浓度， 单位为微克每毫升（ p g / m L ) ; A 标准使用液平均紫外吸光度值； r -摩尔消光系数2 0 0 0 0 ; 。 维生素 K 分子量 4 5 0 . 7 ;1 0 由克每升（ g / L ） 换算成微克侮毫升（ I-c g / m L ） 的换算系数。1 1 高纯氮气 9 9 . 9 %.4 仪器与设备4 . 1 实验室常用设备。4 . 2 打碎机。4 . 3 恒温干燥箱。4 . 4 色潜柱： 为0 . 8 （二 ， X3 0 c m的玻璃柱。底端收缩变细， 装有活塞， 活塞土约 1 c m处有一玻璃筛板，筛板孔径为 1 6 I r m-3 0 t cm。柱上端膨大为容积约 3 0 m l的储液池。 使用前需于燥。4 . 5 旋转蒸发器。 与 旋转蒸发器配套的旋转蒸发瓶： 具塞， 圆底， 容积为 1 5 0 m l , ,4 . 6 恒温水浴锅。4 . 7 高速离心机。 与高速离心机配套的小离心管： 具塞 容积为！5 川 L - - 3 . 0 m l . ,4 . 8 紫外分光光度计。4 . 9 高效液相色谱仪， 带紫外检测器。5 分析步骤 （ 所有操作均需避光进行 ）5 . 1 试样处理5 . 1 . 1 新鲜试样： 去除杂物， 将 可食部洗净， 擦 去表面水分， 切碎， 用打碎机制备成匀浆。避光低温保存。5 . 1 . 2 一于 制试样： 磨碎， 过 6 0日 筛， 混匀， 避光低温保存。5 . 2 试样预处理5 . 2 . 1 提取5 . 2 . 1 . 1 新鲜试样： 准确称取 2 . 0 0 0 g - - 1 0 . 0 0 0 g （ 维生素 K ， 含量不低于2 ji g ) ， 加至具塞锥形瓶中， 加人 5 -1 0 倍体积的丙酮( 3 . 3 ) , 盖土塞子， 振摇 3 min-5 m in , 静置 1 m in 。以下按 5 . 2 . 1 . 3 操作。5 . 2 . 1 . 2 千制试样 ： 称取 0 . 2 0 0 g - 4 . 0 0 0 g （ 维生素 K ， 含量不低T 2 11 g ) ， 加到研钵中， 再加人 2 - , - 4 倍量的无水硫酸钠研磨均匀后， 转人锥形瓶， 加入2 5 m l ， 丙酮， 振摇 3 m i n -5 m i n ， 静置 1 m in ,标准下载网()免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 标准最全面免费标准网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载GB / T 5 0 0 9 . 1 5 8 - 2 0 0 35 . 2 . 1 . 3 将上清液转移至盛有 5 0 mI . 0 . 1 4 m o l / I. 硫酸钠溶液的分液漏斗中， 用 2 5 m L丙酮分 2 次3 次洗涤残渣， 上清液并入分液漏斗。继续用 2 5 mL石油醚( 3 . 4 ) 洗涤锥形瓶 3 次一4 次 ， 至无色为止，并人同一分液漏斗中。振摇 1 m i n ， 静置分层。弃下层水相， 反复用 0 . 1 4 m o l/ I ， 硫酸钠溶液洗涤有机相， 至水相澄清为止。将有机相通过盛有无水硫酸钠的漏斗， 滤至旋转蒸发瓶中， 用石油醚洗涤分液漏斗和无水硫酸钠层 ， 洗涤液并人旋转蒸发瓶 。5 . 2 . 1 . 4 浓缩与定容 ： 将上述提取液于旋转蒸发器上减压蒸发， 水浴温度 8 0 0C , 蒸发至约 1 mL ， 取下旋转蒸发瓶用氮气吹干 ， 加入 2 . 0 m l , 石油醚溶解并定容。备柱色谱用。5 . 2 . 2 柱色谱5 . 2 . 2 . 1 装柱： 取干燥色谱柱 ， 将验证好的氧化铝浸泡于石油醚中， 湿法填充色谱柱， 使氧化铝 自由均匀流下， 至柱高为 2 0 c m， 其上端再加 1 c m无水硫酸钠。打开活塞 ， 调整流速为每秒 1 滴。5 . 2 . 2 . 2 色谱分离： 待石油醚流至柱上端 0 . 5 c m时 ， 加 1 M I 一 试样提取液， 待提取液流至与柱上端平齐时， 加 2 m L石油醚冲洗柱壁。再加 1 0 m L石油醚 2 次， 洗涤， 弃除流出液。然后， 用 3 0 m l , 洗脱液洗脱， 用旋转蒸发瓶收集流出液。5 . 2 . 2 . 3 浓缩定容： 将上述流出液于旋转蒸发器浓缩至近干 ， 取下用氮气吹千后， 用正 己烷定容为2 ml . .5 . 3 测定 将定容液移人小塑料离心管中， 离心 5 m i n ( 5 0 0 0 r / m i n ) ， 上清液供 H P L C分析。5 . 3 . 1 高效液相色谱分析条件（ 参考条件） 预柱u l t r a s p h e r e O D S , 粒度 1 0 m， 规格 4 . 0 m m X 4 5 m m, 分析柱u lt r a s p h e r e O D S , 粒度 5 p m， 规格 4 . 6 m mX 2 5 0 m m. 流动相甲醇正己烷（( 9 8 +2 ) , 流 速 1 . 5 m l . / m i n a 进样量2 0 p .L o 检测器紫外检测器 ， 波长 2 4 8 n m， 量程 0 . 0 1 -0 . 0 5 05 . 3 . 2 定f测定5 . 3 . 2 . 1 仪器稳定性测定 ： 按高效液相色谱仪说明书调整仪器操作参数和灵敏度（ A U F S ) ， 为准确测定， 按要求对分析柱进行系统适应性实验。取标准使用液按分析条件进样测定， 连续 6次， 计算峰面积或峰高的平均值 、 标准差和相对标准差 （ R S D) ， 如果 R S DGI %， 说明仪器稳定性 良好， 可进行试样测定 。5 . 3 . 2 . 2 标准曲线： 分别取维生素K ， 标准使用液0 . 5 0 , 1 . 0 0 , 2 . 0 0 , 4 . 0 0 , 6 . 0 0 , 8 . 0 0 , 1 0 . 0 0 m 1 ， 加人分液漏斗中， 按试样提取和柱色谱步骤处理， 最后浓缩定容至 1 . 0 M L ， 即标准工作曲线中各点维生素K ， 含量分别相当于 5 . 0 , 1 0 . 0 , 2 0 . 0 , 4 0 , 0 , 6 0 . 0 , 8 0 . 0 , 1 0 0 . 0 t .g / mL 。按 5 . 3 . 1 分析条件进行测定 ， 记录峰面积或峰高。以维生素 K ,