幼鼠颞叶癫痫模型匹罗卡品致痫后潜伏期末海马的形态学以及蛋白表达谱变化.pdf

， z ( 6 ) ： w w w c s 啪 e a -o r s j h 脚一- n e t DO I I O 3 9 6 9 j 5 s s n 1 6 7 2 7 3 4 7 2 0 1 3 0 6 0 0 3 h t t p ： x b y x x y s m,n e t x b wk fi l e u p P DF 2 0 1 3 0 6 5 6 0 p d f 幼鼠颞叶癫痫模型匹罗卡品致痫后潜伏期末海马的形态学 以及蛋白表达谱变化 吴丽文，尹飞，彭镜 ，何芳 ，张慈柳 ，邓小鹿 ，王国丽 ( 中南大学湘雅医院儿科教研室，长沙 4 1 0 0 0 8 J 摘要 】 目的 ： 研究发育期大 鼠慢性内侧颞 叶癫痫 ( m e s i a l t e m p o r a l l o b e e p i l e p s y ， MT L E ) 模型潜伏期末海马的形态 学以及蛋 白表达谱变化 ，揭示慢性 MT L E发病机制。方法 ：建立氯化锂 一 匹罗卡品诱导的发育期大鼠 MT L E模型， 取致痫后 3 周末的对照组 ( = 2 0 ) 和 MT L E模型组 ( n = 2 0 ) 大鼠为研究对象，尼氏及 T i m m染色观察海马神经元丢失和 苔藓纤维出芽情况 ；采用二维凝胶 电泳 ( t w o d i me n s i o n a l g e l e l e c t r o p h o r e s i s ，2 - D E ) 结合质谱分析对两组间的差异表达蛋 白质进行鉴定 ；We s t e r n印迹对部分差异表达蛋白进行 印证。结果 ：MT L E模型组海马内可见明显的海马神经元丢失 和苔藓纤维出芽 ；建立 了发育期大鼠慢性 MT L E 模型潜伏期末的海马蛋 白质 2 - D E 图谱 ，共鉴定了差异表达蛋 白质 3 1 个 ，分别属于神经递质和突触发生相关的蛋 白、细胞骨架蛋 白、细胞连接蛋 白、能量代谢和线粒体功能蛋 白、生物 活性酶类 、细胞结构相关蛋 白质 以及信号转导相关蛋 白质等；We s t e r n 印迹对部分蛋白水平检测的结果与蛋 白质组学 结果一致 。结论 ：D y n a m i n 一 1 ，n e u r o g r a n i n 和 u b i q u i t i n 等一系列突触相关 的蛋白表达异常 ，可导致突触重构 、异常苔 藓纤维增生和异常神经兴奋环路的形成 ，是 MT L E发病机制 中至关重要 的环节。 【 关键词 】内侧颞叶癫痫 ；海马；潜伏期 ；发病机制 ；蛋 白质组学 Mo r p h o l o g y a n d d i f f e r e n t i a l l y e xp r e s s e d p r o t e i n s i n h i pp o c a mpu s o f me s i a l t e m p or a l l ob e e p i l e p s y m o d e l o f l m m at Ur e r a t S naUCed Dy Dl l oC ar Di ne 。 WU L i w e n ， Y I N F e i , P E NGJ i n g ， HE F a n g ， Z HA NG C i l i u , DE N G X i a o l u ， WA NG G u o l i ( D e p a r t m e n t o f P e d i a t r i c s , X i a n g y a H o s p i t a lj C e n t r a l S o u t h U n i v e r s i t y , C h a n g s h a 4 1 0 0 0 8 , C h i n a ) A B S T l U T Ob j e c ti v e ： T o e x a mi n e t h e c h a n g e s o f mo r p h o l o g y a n d d i f f e r e n t i a l l y e x p r e s s e d p r o t e i n s i n h i p p o c a mp u s a t t h e l a t e n t s t a g e o f c h r o n i c me s i a l t e m p o r a l l o b e e p i l e p s y ( MT L E ) i n i mma t u r e r a t s ， a n d t o e x p l o r e t h e g l o b a l me c ha n i s m o f c h r o n i c M TL E a t a n e w p o i nt 收稿 日期 ( D a t e o f r e c e p t i o n 】 ：2 0 1 2 “0 9 1 9 作者简介 ( B i o g r a p h y ) ：吴丽文，博士，主治医师，主要从事小儿神经系统疾病的研究。 通信作者 ( C o r r e s p o n d i n g a u t h o r ) ：尹飞， E m a i h y f 2 3 2 3 h o t m a i l c o m 基金项目( F o u n d a t i o n i t e m s ) ：国家自然科学基金青年基金( 8 1 1 0 0 8 4 6 1) ；中南大学青年教师助推项目( 2 0 1 1 Q N Z T 1 5 2 ) 。I b i s w o r k w a s s u p p o r t e d b yt h e Na t i o n a l Na t u r al S c i e n c e F o u n d a t i o n o f Ch i n a Y o u th F u n dP r 0 j e c t ( 8 1 1 0 0 8 4 6 ) a n d Y o u n g T e a c h e r s o f C e n t r al S o u t hUn iv e r s i t yB o o s t e r P r o j e c t ， P R C h i n a ( 2 0 1 1 Q N Z T 1 S 2 ) 幼鼠颞叶癫痫模型匹罗卡品致痫后潜伏期末海马的形态学以及蛋白表达谱变化吴丽文，等 M e t hods ：M TL E m o d e l s o f i mma t u r e r a t s we r e i nd u c e d b y l i t h i u m p i l o c a r pi ne Th e r a t s we r e d iv i d e d i n t o 2 g r o u p s r a n d o m ly ： a c o n t r o l g r o u p( n = 2 0 ) a n d a n MT L E m o d e l g r o u p( n = 2 0 ) A t t h e l a t e n t s t a g e , n i s s l a nd Ti mm s t a i ni n g we r e pe r f o r m e d t o e v a l u a t e t he c e l l l o s s a n d mo s s y fi be r s p r o u t i n g T he d i ff e r e n t i a l l y e x pr e s s e d pr o t e i ns we r e s e pa r a t e d b y 2 - d i m e n s i o n a l po l y a c r y l a mi d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s ( 2 - D E ) c o mb i n e d wi t h ma t r i x a s s i s t e d l a s e r d e s o r p t i o n i o n i z a t i o n t i me o f fl i g h t ma s s s p e c t r o me t r y( MA L DI - T OF MS ) t e c h n o l o g y We s t e r n b l o t w a s u s e d t o d e t e r mi n e t h e d i ff e r e n t i a l l y e x p r e s s i o n l e v e l s o f pa r t i a l pr o t e i ns Re s ul t s ：Ne ur on l o s s a n d a bn or m a l mos s y fibe r s p r ou t i ng we r e o bv i o us l y o bs e r ve d i n t he h i p po c a mp u s i n t he M TLE mo de l g r o u p； 2- DE p a t t e r n s o f h i p po c a mp us o f t he M TLE mo de l g r o u p i n l a t e n t s t a g e a nd t he c o nt r o l g r o u p we r e e s t a b l i s he d q hi r t y - o ne d i ff e r e n t i a l p r o t e i ns we r e i d e nt i fie d b y M_ KLDI - TOF M S ， wh i c h we r e c a t e g o r i z e d i n t o s e v e r al g r o u p s b y bi o l o g i c al f u n c t i o n s ： s y n a p t i c a n d n e u r o t r a n s mi t t e r r e l e a s e r e l a t e d p r o t e i n s ， c y t o s k e l e t a l p r o t e i n s J c e l l j u n c t i o n s pr o t e i n s ， e ne r g y me t a bo l i s m a n d mi t o c h o nd r i a l p r o t e i ns ， b i o l o g i c a l e nz y me s J c e l l u l a r s t r u c t u r e r e l a t e d pr o t e i ns ， s i g n a l r e g u l a t i n g mo l e c u l a r a n d o t he r s Th e e x p r e s s i o n l e v e l s o f p a r t i a l p r o t e i n s de t e r mi n e d b y W e s t e r n b l ot we r e s i mi l a r t o t h e c h a n g e s o f pr o t e o mi c s Co nc l us i o n：“ t he d i ffe r e n t i a l l y e x p r e s s e d p r o t e i ns o f s y n a ps e r e l a t e d p r o t e i n s s uc h a s d y na mi n l ， ne ur o g r a n i n a nd u bi qu i t i n ， wh i c h c a us e t he s y na ps e r e o r g a n i z a t i o n a nd mo s s y f i be r t e r mi na l s p r o u t i n g r e l a t e d t o t h e f o r ma t i o n o f a bn o r ma l e x c i t a t o r y ne t wo r k , pr o b a b l y p l a y c r i t i c r o l e s i n t h e me c h a n i s m o f M TI ， E KE Y W O RDS me s i a l t e mp o r al l o b e e p i l e ps y ； hi p po c a mp u s ； l a t e nt s t a g e ； p a t ho g e ne s i s ； pr o t e o mi c s 内侧颞 叶癫痫( me s i a l t e mp o r a l l o b e e p i l e p s y ， MT L E ) 是最常见的难治性癫痫之一 ，以海马硬化为 其突 出的临床病理特征L l l 。目前普遍认为MT L E 的 形成原因与婴幼儿早期海马损伤有关_ 2 ，在外伤 、 热性惊厥 、感染等导致海马急性损伤后 ，经历一个 相对静止的潜伏期 ，到慢性阶段 出现反复的颞叶起 源的部分运动性发作。其中，急性期海马损伤后的 潜伏期阶段 内，由于突触的可塑性和神经再生的作 用 ，海马异常神经兴奋环路的形成是慢性期 自发癫 痫发作的基础_ 3 J 。因此 ，探讨急性期海马损伤后潜 伏期内海马的各种病理生理改变 ，将从一个全新的 角度全面揭示MT L E 的发病机制。 氯化 锂一 匹罗卡 品点燃 大 鼠模 型是 国际上 比 较公认 的在发病机制 、癫痫发作类型 以及神经病 理学方面均能模仿人类MT L E 的一个动物模型L 4 J 。 在急性 期匹罗卡品点燃发作后 ，模型大 鼠经历典 型的急性期 、潜伏期 以及 出现反复 自发发作的慢 性期 阶段 。为此 ，作者采用氯化锂一 匹罗卡品对幼 鼠进行诱导 ，在 自发发作 出现前的潜伏期末对 大 鼠海 马的形态学进行观察 ，进一步运用蛋 白质组 学在分子水平全面探讨此 阶段 内海马全蛋 白表达 谱 的变 化情况 ，对相关差异表达蛋 白进行分析整 理 ，寻求与MTL E 发病机制密切相关 的蛋 白表 达 网 ，结 合宏观 的海马形态学变化情况 ，为探讨 慢 性 MT L E 发病 机制 开辟 一个 全新 的视 角 。 1材料与方法 1 1实验动物及分组 3 周龄健康s D大鼠( 清洁级) ，雌雄不限 ，由中 南大学湘雅 医学 院动物部提供。分对照组 和模 型 组 ，每组动物2 o 只。 1 2主要试剂 及仪器 匹罗 卡 品 、丙戊 酸 、焦 油 紫 、硝 酸 银 、二 硫 苏糖醇 ( DT T) 、三氟乙酸、乙腈 、经甲苯磺酰苯 丙胺酰 甲酮处理的一 胰蛋 白酶、 ， 腈基一 4 一 羟基肉桂 酸( C C A ) 等购 白美国S i g ma 公司 ；2 D蛋 白定量试剂 盒 、丙烯酰胺 、甘氨酸 、十二烷基硫酸钠( S DS ) 、 I P G 缓 冲液( p H4 7 ) 、硫脲 、3 一 ( 3 一 胆酰胺基丙基) 二甲基氨基 ， l 一 丙磺酸盐( CHA P S ) 、2 4 c m固相化 p H梯度干胶条 ( 4 7 ) 、考马斯亮蓝 G一 2 5 0 等购 自 瑞士A me r s h a n B i o s c i e n c e s 公司；兔抗 鼠d y n a mi n 1 多克隆抗体 、兔抗 鼠n e u r o g r a n i n 多克隆抗体 、兔 抗 鼠u b i q u i t i n 多克隆抗体 、羊抗 鼠p e r o x i r e d o x i n l ( P R X 一 1 ) 多克隆抗体 、羊抗 鼠c o n n e x i n 5 0 多克隆抗 中南大学学报 ( 医学版 ) ， 2 0 1 3 ， 3 8 ( 6 )h tt p ： w w w c s u m e d o r g ； h t t p ： x b y x x y s m n e t 体 、兔抗鼠B a c t i n 抗体购 自美 A b c a m公司 ；辣根 过氧化物酶标记的兔抗羊二抗 、羊抗兔二抗 、超敏 化学发光( E C L ) 试剂盒购 自瑞典A me r s h a m公司。 1 3模型制备 MT L E 模型组 ：氯化锂 1 2 7 mg k g ( Ge n v i e w公 司，溶于生理盐水 ，新鲜配制) 腹腔注射 ，1 7 1 8 h 后根据分组情况腹腔注射匹罗卡品5 0 mg k g ( S i g ma 公 司 ，溶 于生理盐水 ，新鲜配制 ) 诱 导 至癫 痫发 作 ，根据L a d o 幼 鼠癫痫发作分级标准 5 判定癫痫发 作 的程度 ，达到癫痫持续状态( s t a t u s e p i l e p t i c u s ， S E ) 9 0 mi n 后或濒危时予水合氯醛3 0 0 mg k g 腹腔注 射终止发作 。对 照组 ：予生理盐水腹腔注射代替 匹罗卡品，余同MT L E 模型组。 1 4海马形态学观察 以往实验 证 明 ：在匹罗卡品致痫后3 周左 右MT L E 模型组大鼠开始 出现 自发痫性发作 ，所以 急性期后至致痫后3 周这一 阶段作为潜伏期 ，在致 痫后3 周末( 即潜伏期 ) 分别将对照组大鼠和开始 出 现 白发痫性发作的MT L E 模 型大 鼠予2 戍 巴比妥 6 0 mg k g 深麻 醉 ，O 4 硫 化 钠 缓 冲液 及 4 多 聚 甲 醛灌注 、取脑 ，4 多聚甲醛后 固定 ，置3 0 蔗糖 4 过夜 。在海马部位做冠状连续冰冻切片 ，分别 行尼氏( 6 m厚) 及T i mm 染色( 3 0 l m厚) 。 1 4 1尼氏染 色 切片晾干后 ，0 1 焦油紫染色 1 0 mi n，分色 ( 镜下掌握时间) ，梯度酒精脱水 ，二 甲苯透明，中 性树胶封片。镜下观察并半定量评价C A1 ，C A3 和 齿状回( d e n t a t e g y r u s ，DG ) 的神经细胞丢失程度。 1 4 2 Ti mm染 色 暗 室 中将 晾干切 片浸 入新 鲜配 制 的孵育 液 ( 5 0 阿拉伯胶6 0 mL ，柠檬酸缓冲液1 0 mL ，5 6 氢 醌3 o mL，1 7 硝酸银1 5 mY ) 中孵育4 o 6 0 rai n ，取 出切 片后 自来水充分冲洗 ，脱 水 ，透 明 ，中性树 胶封 片。光镜下观察齿状 回内分子层苔藓纤维 出 芽 情况 。 1 5海马蛋白表达谱 的蛋 白质组学分析 1 5 1提取海马总蛋 白 于致痫后3 周末将两组大鼠灌注处死 ，断头取 脑 ，分离海 马。加入组织裂解液 8 mo l L尿素 ， 2 mo l L硫 脲 ，l 0 0 mmo l L D T T，4 C HA P S ， 0 S mmo l L 乙二胺 四 乙酸 ，4 0 mmo l L T r i s ，2 NP 4 0 ， 1 T r i t o n X 1 0 0 ，5 mmo l L 苯 甲基磺酰氟 ( P MS F ) 和2 P h a ma r l y t e 提取海马总蛋白。用蛋白 定量试剂盒测定蛋 白浓度 。为消除个体误差 ，两 组大 鼠各取8 只分别提取海马总蛋 白，待浓度测定 后等量 混后 行2 一 DE 电泳 。 1 5 2 2 - DE电泳及 染色 分别取海马总蛋白各1 0 0 0 ，分别与水化液、 D q T 和I P G 缓冲液( p H4 7 ) 混合至总体积为4 5 0 。蛋 白样本于I P G p h o r 等电聚焦仪上按如下条件：3 0 V 水 化 1 3 h ，5 0 0 V 1 h ，1 0 0 0 V 1 h ，5 0 0 0 V 1 h ，8 0 0 0 V8 5 h 。然后取 出胶条平衡 后移至凝胶上端 ，进行 S D S 一 聚 丙烯酰胺凝胶电泳 ，考马斯亮兰染色过夜。 1 5 3图像 分析 通过I ma g e s c a n n e r 扫描仪对凝胶进行扫描获取 图像 ，借助P DQ u e s t 软件分析 ，根据斑点的位置 、 大小 等 ，自动将 不 同图谱 中 的相 同蛋 白质点 匹 配 ，表达水平相差两倍 以上的视为差异表达蛋 白 质点 。 1 5 4基质辅助激光解吸 电离飞行时间质谱 分析 切割选定的蛋 白质点 ，洗胶 、脱色 、酶解过 夜。收集上清液后萃取 ，冷冻浓缩至总体积2 5 L 后点板 。在基质辅助激光解吸 电离飞行时间质谱 仪 ( MA L DI T OF MS )上进行分析 ，获得肽质量指 纹图谱( p e p t i d e ma s s f i n g e r p r i n t ，P MF ) ，Ma s c o t 软 件检索 ，S w i s s P r o t 数据库鉴定蛋 白质。 1 6部分差异表达蛋白质的We s t e r n印迹 使 用We s t e r n 印迹 方 法检 测 两组 间的差 异 表达蛋 白质 W u b i q u i t i n，P R X l ，c o n n e x i n 5 0 ， d y n a mi n l ，n e u r o g r a n i n 等的表达情况 ，对蛋 白质 组学方法进行印证 。 1 7统计学处理 应用S P S S 1 3 0 统计软件对实验结果 进行统计 学分析 ，两组 比较用f 检验 ，p 0 o 5 为差异有统计 学 意义 。 2结 果 2 1 MT L E模型制备结果 急性期 匹罗卡品注射5 3 0 mi n ，动物开始出 现 机械性 咀嚼 、连续性点头 、单侧前肢 阵挛 、前 肢交替 阵挛 ，随后出现双侧前肢阵挛 、后退 、摔 倒 ，最后出现狂奔嘶叫、强直发作。MT L E 模型组 大 鼠有 l 8 只达到s E ，存活1 2 只 ，成功率为6 0 ，生 理盐水对照组2 0 只均未见癫痫发作 。s E 后进入潜 伏期 ，经过2 2 3 8 ( 2 7 3 + 4 5 ) d 后进人慢性期 ，其中 7 R幼 鼠( 占5 8 3 ) 开始出现程度不等的 自发痫性发 作( s p o n t a n e o u s r e c u r r e n t s e i z u r e s ，S R S ) ，多数表现 为机械性点头 、咀嚼、呆滞 、凝视 、活动减少 、面 9 鼠颢叶癫痫模型 罗卡品致痫后潜伏期末海马的形态学以及蛋白表达谱变化吴丽文，等 【 抽动 、单侧前肢阵挛等部分运动性发作 ，少数表 为双侧前肢阵挛 、全身强直痉挛发作。持续时间 超过6 0 s ，发作缓解后活动 自如。平均l 周 内发作 3 5 + 1 8 ) 次 。对照组 幼 鼠始终未 出现S R S 。 2海马形态学分析结果 2 1尼氏染 色 尼 氏染 色主要观察潜伏期末对照组 和MT L E 亳 型组 大 鼠海 马各 区神 经元 的变 化情 况 。在 生 光学显微镜4 倍 物镜下 观察海马 ，发现对照组 季 马各 区轮廓 清晰 ，神 经元 形 态较 完整 ，胞 浆 尼 氏小 体丰 富 。MTL E 模型组 除D G区仍可 见 廓外 ，其余 各 区如 门区 、C A1 区 、CA 3 区神经 己 脱失 严重 ，轮廓 欠清 晰 。于4 0 倍物 镜下 观察 亚 区神经 元形 态及 计 数神 经元 数 目，发现对 组 大 鼠DG区 颗 粒 细 胞 、C A3 区 、C A1 区 锥 体 日 胞数 量众 多 ，排列 紧 密整 齐 ，细胞 轮廓 清 晰 ( 图 1 A，l C，l E ) 。MTL E 模 型组发 现DG区颗粒 细胞 、cA3 区及 cAl 区锥 体 细胞脱 失 明显 ，以 C A3 区和cA1 区较 为严 重 ，两 区神 经元 排列 松 散 ，胞体 肿胀 ，轮 廓不 清 ，胞 核结构 模糊 ，核 仁 不 明显 ，甚 至消 失 ，仅残 留少 量肿 胀神 经元 ( 图 1 B， l D，1 F ) ；与 对 照组 比较 ，各 神 经元 数 目的差异均有统计学意义( P 0 0 5 ) 。 2 2 2 Ti mm染 色 T i mm染 色主要用 于观察 海马CA 3 区 以及DG 内分 子 层 异 常 增 生 的 苔 藓 纤 维情 况 。对 照组 大 鼠 诲 马C A 3 区以及齿状 回内分子层未见 明显T i mm颗 粒 ( 图2 A，2 C) ；MT L E 模 型组大 鼠海马C A 3 区锥 体细胞层 内见有 明显的T i mm颗粒f 图2 B ) ，呈不连 续 或 连 续 分 布 与 对 照 组 相 比差异 有 统 计 学 意 义 ( P O O 1 ) ；MT L E 模 型组组 内分子层 可 见T i mm颗粒 ( 图2 D) ，但多散在分布 ，少有连续分布者 ，与对 照组相比差异有统计学意义( P 5 1 分( P 0 0 S ) 则认为得到鉴定 ，否则视为未 得到鉴定 。根据不同时间点两两之间的2 D E 图谱的 图像分析结果 ，共鉴定了差异表达2 倍以上的蛋 白 质斑点3 1 个 ，其 中l 7 个在对照组表达上调 ，l 4 个在 模型组表达上调，其详细信息见表l 。根据S WI S S P R O T 和NC B I 数 据库 中提供 的所鉴定 蛋 白质 的功能 注释 ，可将所有鉴定的差异表达蛋白质初步分为以 下几类 ：细胞骨架蛋白、细胞连接蛋 白、能量代谢 和线粒体功能蛋白、神经递质和突触发生相关的蛋 幼鼠颢叶癫痫模型 罗卡品致痫后潜伏期木海马的形态学以及蛋一表达谱变化吴丽文，等 白 、生 物 活性酶 类 、细胞结 构相 关蛋 白质 以及信 号 转导相关蛋 白质等( 表2 ) 。 2 4 We s t e r n印迹分析 为 验 证 蛋 白 质 组 学 研 究 的 结 果 ， 采 用 We S t e r n 印 迹 方 法 检 测 差 异 蛋 I I_=j c o n n e x i n 一 5 0， LC d y n a mi n 一 1 ，n e u r o g r a n i n ，P R X l 及u b i q u i t i n 在模 型组和对照组海马中总蛋白中的表达水平 ( 图5 ) 。 结 果显 示 除d y n a mi n 一 1 在 模 型组 表 达增 高外 ， c o n n e x i n 一 5 0 ，n e u r o g r a n i n ，P R X 一 1 Lu b i q u i t i n 均 在 对 照 组 高 表 达 ，所 检 测 的 各 蛋 白的 表达 水 平 变 化 符合蛋 白质组学结果。 1 1 1 1 1 篙 _ - 鬈 。 簟 辅 ； 图3对照组和模型组海马总蛋白2 D E 图谱。L C：对照组 ；L S ：MT L E 模型组。箭头所爪为两组问差异表达2 俯以上的货r 质 斑点 。 Fi g ur e 3 2- DE ge l i ma g e s ofh i ppoc a m p a l pr ot e i n i n t he c on t r ol gr ou p a nd t he M TLE m o de l g r o up LC： Co nt r o l g r ou p； LS ：MTLE mo de l g r ou p Th e a r r o ws s ho w t he di ffe r e nt i a l e x pr e s s i on p r o t e i n b y mor e t h a n 2 t i me s be t we e n t h e t wo g r o up s 驽 、 L s 窖 Conn ex i n 50 Dyn ami n - 1 躲 ， 蠹 簟 磐 Neu r o gr ani n PRX一 1 Ubi qu i t i n 图4局部放大的部分差异表达蛋白质点。L C：对照组；L S ：MT L E 模型组。 Fi g ur e 4 Pa r t i a l d i ffe r e n t i a l l ypr ot e i n s pot s wi t h l oc a l a mpl i fic a t i on LC： Con t r o l g r ou p ；LS： M TLE mo de l g r o u p 中南大学学报 ( 医学版 ) ， 2 0 1 3 ， 3 8 ( 6 ) h t t p ： w ww c s u me d o r g ； h t t p ： x b y x x y s mn e t 表1 MA L DI - T OF MS 质谱鉴定的两组间的差异表达蛋白 Ta b l e 1 I de n t i fic a t i ono ft hedi ffe r e ntia l l ye x pr e s s e dpr o t e i nsb yMALDI - TOF MSbe t we e nt he c o nt r o l g r ou pa ndt h eMTLEmode l gr o up 幼鼠颞叶癫痫模型匹罗卡品致痫后潜伏期末海马的形态学以及蛋白表达谱变化吴丽文 ，等 表2 所鉴定 的差异 表达蛋 白的功能归类 LC LS 图s 部分差异表达 蛋白的we s t e r n印迹 结果。 L C：对照组 ；L S ：MT L E 模 型组。 F i g l l s w e s t e r n bl o t r e s u l t s of pa r t i a I d i ffe r en t i a I e x pr e s s e d pr ot e i ns LC： Co nt r ol g r 。 P j Ls ： M TLE m。 de 1 gr o P 3讨 论 海马神经元丢失和苔藓纤维 出芽是MTL E 海 马的一个特征性 改变。神经元脱失在癫痫发生发 p _ a c t i n 展 中的作用也不是十分清楚 ，但大多数学者 认 为神经元脱 失在MT L E 发展 中起重要作 用 ， 癫痫 的发生是与神经元脱 失同步发生 的神经元网 络缺 损所致 ，同时认 为癫痫起始部位 、异常放 电 尝 尝 l 尝 罄 - 中南大学学报 ( 医学版 ) J 2 0 1 3 ， 3 8 ( 6 )h t t p ： w w w c s u me d o r g ； h t t p ： x b y x x y s m n e t 的传播 以及癫痫 的临床表现与神经元脱失部位有 关。近年来 随着研究深入 ，人们发现神经元对损 伤的反应有 内在的促进结构再生 出芽 的功能 ，其 损伤 ，特别是C A 3 区神经元损伤诱导形成新的高兴 奋性 环路 和神经元 的可塑性 ，进而导致 了 自发痫 性发作【 7 ；其凋亡可能导致抑制性功能障碍 ，增加 了癫痫的敏感性 8 。虽然两者之间的精确关系尚不 清楚 ，但综上仍证实 了神经元脱失在促进苔藓纤 维出芽及癫痫发生中的重要作用。 突 触 重 建 指 的 是 癫 痫 的 一 种 病 理 改 变 ， 刺 激 损 伤 后 海 马 突 触 回路 中 多个 部 位 均 可 出 现 突 触 结 构 和 功 能 的 重 组 ， 是 海 马 结 构 和 功 能 可 塑性 的 体 现 ，对 海 马 电 生 理 活 动 的调 节 具 有重 要 意义 ，与癫痫 的发生 密切 相关 J 。突 触重 建 中最有 代表性 的是 苔藓纤 维 出芽 ( mo s s y f i b e r s P r o u t i n g ，MF S ) ，病理条 件下 ，苔藓纤 维 形成 新 的轴 突沿海 马横 轴或 纵轴 返 回至 内分 子 层或 上颗 粒层 ，在 此 与它们 自己的树 突形 成 新 的突 触联 系 ， 同时芽生 的轴 突侧枝 也 可 以在 CA3 区透 明层 与锥 体 细胞轴 突形 成新 的突触 联 系 ，导致 了海 马环 路 内的兴奋性 高度 异常 。 MF S 的发生机制 以及在癫痫发病机制中的作用至今 不 明，且存在着较 大争议 。大多数研究n 已证实 MF S 形成的新突触为兴奋性谷氨酸能突触 ，提示苔 藓纤维是兴奋性神经通路 ，MF S 是癫痫 自发发作 的病理基础 ，促进 了癫痫的发生 。 W Wa u r i n 等 研究海人 酸致痫后DG内分子层MF S 的动态变化与 颗粒细胞 间兴奋性突触后电流的关 系 ，发现随着 MF S 评分的增加 ，DG区颗粒细胞兴奋性传人逐渐 增 强 。 本 实验 中 ，急性 期 匹罗卡 品点 燃致 痫后 ， 由于缺血和兴奋性中毒损伤 ，海 马神经元出现变 性 、坏死 ，在潜伏期末神经元脱失达到高峰 ，以 C A1 区和C A 3 区较为明显 ，海马结构模糊不清。同 时 ，潜伏期末在海马 的齿状 回内分子层及C A3 区 开始 出现 了MF S ，说 明在海马损伤后形成新 的突 触联系 ，这些异常突触的形成构成 了海马 内部复 发性兴奋性环路的基础 ，从 而易化 了痫性放 电的 产生与扩散 。以上海马形态学改变均是宏观的神 经病理学变化 ，那么 ，可推测在分子水平上面 ， MT L E 海 马的蛋 白表达谱可能存在相应的改变。为 此 ，本研究运用蛋 白质组学方法筛选 出幼 鼠点燃 模型 中潜伏期末的对照组和模 型组 的差异表达蛋 白质 ，试图 明确慢性 自发发作 出现之前的海马全 蛋 白表达谱的变化 ，从一个全面 的角度分析蛋 白 以及各种蛋 白酶体等信号通路 的改变在癫痫发生 中的作用 。结果发现 ：细胞骨架蛋 白、细胞连接 蛋 白、能量代谢和线粒体 功能蛋 白、神经递质和 突触发生相关 的蛋 白、生物活性酶类 、细胞结构 相关蛋白质以及信号转导相关蛋白质等一系列蛋 白 质在慢性癫痫发生发展的机制 中有着重要作用。其 中，与神经元坏死以及苔藓纤维突触重构等密切相 关 的蛋 白有d y n a mi n l ，n e u r o g r a n i n q u b i q u i t i n 等 ， 可见 ，在分子水平上的蛋 白表达谱 的变化导致 的 海 马形态学改变而形成异常 的神经兴奋环路 ，是 MT L E 慢性期癫痫发作的病理生理基础。 Dy n a mi n l 是一个GT P 水解蛋 白，主要在突触 前 膜表达 ，是 网格蛋 白介导 的突触囊泡胞吞作用 的一个关键的调控蛋白，在调控神经递质的胞吞 胞吐中发挥重要作用 1 。Dy n a mi n 一 1 能够间接调节 神经递质的装载 和释放 ，导致癫痫性突触传导减 少 ，是一个潜在 的抗癫痫药物 的治疗靶点 ，而且 具有副作用少 的优点 。本研究中，d y n a mi n 1 在潜 伏期末的MT L E 模型鼠中高表达，表明在癫痫 自发 发作开始前 已经存在突触囊泡神经递质 的释放和 回收异常 。Ne u r o g r a n i n 是一个神经系统特异性表 达蛋 白，在海 马尤其是海马神经元树突棘 的突触 后膜有高表达 ，是突触后信号通路以及突触发生 的一个重要 的调控蛋 白E l 4 。受c a 浓度 以及 自身 磷酸化状态等 的影响 ，n e u r o g r a n i n 通过刺激钙调 节信号通路可以强化长时程电位从 而影 响海 马内 的神经电环路 。L i u 等 J 应用蛋 白质组学研究发 现 ，n e u r o g r a n i n 在匹罗卡品诱导的MT L E 模型 鼠海 马中有差异表达。作者的实验表明：n e u r o g r a n i n 在 MT L E 模型 鼠表达下调 ，可能提示n e u r o g r a n i n J 过 改变磷酸化状态 以及与微管蛋 白等的相互作用调 控突触后信号通路 ，从而参与难治性MT L E 的致病 机制 。U b i q u i t i n 是一个小分子热休克蛋 白，广泛 存在于真核细胞 ，是能量依赖 的泛素一 蛋 白酶体 的 重要成分 。它的主要作用是以多聚泛素链 的形式 与要降解的底物蛋 白结合 ，从而标记底物蛋 白， 以便于下一步降解蛋 白 1 7 1 。Ub i q u i t i n 与细胞骨架 结构 、细胞连接 、黏附和移行 、细胞表面受体和 离子通道 的调控等都密切 相关_ 1 。研究 _ l 表 明： 泛素在幼 鼠突触 发育成熟 以及功能方 面扮演一个 相 当重要 的角色 ，采用基 因敲除 鼠敲除泛素表达 后可能引发突触 功能障碍导致的一系列疾病 。以 往多项关于癫痫 患者和试验性癫痫 动物模型 中均 有发现泛素存在差异性表达 】 ，本实验发现泛素 在幼鼠MT L E 动物模型潜伏期末表达下调 ，提示泛 素及其相应 的泛素一 蛋 白酶体途径是MT L E 发病机 制中的一条重要调控通路。综上所述 ，d y n a mi n 一 1 主要作用于突触前膜 ，n e u r o g r a n i n 1 作用于突触后 膜 ，lu b i q u i t i n 在突触发育成熟以及功能发挥方面 幼鼠颞叶癫痫模型匹罗卡品致痫后潜伏期末海马的形态学以及蛋白表达谱变化吴丽文，等 5 6 9 有重要作用 。显然 ，突触与癫痫的发病机制以及 耐药机制 等密切相关 ，也是抗癫痫 药物重要 的治 疗靶点 ，与突触功能密切相关的蛋 白d y n a mi n 一 1 ， n e u r o g r a n i n 和u b i q u i t i n lJ 在这一病理生理机制中扮 演至关重要 的角色。因此 ，一 系列 突触相关 的蛋 白表达的异常 ，导致 突触重构 和异 常苔藓纤维增 生 ，异常神经兴奋环路形成是MT L E 发病机制中至 关重要 的环节 ，其具体调控机制有待今后进一步 的研 究发 现 。 参考 文献 4 7 9 1 0 Wu L ， P e n g 3 ， We i C ， e t a 1 Ch a r a c t e r i z a t i o n ， u s i n g c o mp a r a t i v e p r ot e o mi c s ，o f d i f f e r e n t i a l ly e x p r e s s e d p r o t e i n s i n t h e h i p p o c a mp u s o f t h e me s i al t e mp o r a l l o b e o f e p i l e p t i c r a t s f o l l o wi n g t r e a t me n t wi t h v al p ro a t e J A m i n o A c i d s ， 2 0 1 l ， 4 o ( 1 ) ： 2 2 1 2 3 8 Da ma y e C A ， Wu P e n g e t a 1 A n e x p e r i me n t a l s t u d y o n d y n a mi c mo r p h o l o g i c a l c h a n g e s a n d e x p r e s s i o n p a t t e r n o f GF AP a n d s y n a ps i n i i n t h e h i p p o c a mp u s o f MT L E mo d e l s f o r i mma t u r e r a t s J I n t J Ne u r o s c i , 2 0 1 1 ， 1 2 1 ( 1 O ) ： 5 7 5 - $ 8 8 K u ma r G ， J 0 n e s NC ， Mo r r i s ML e t a 1 E a r ly l i f e s t r e s s e n h a n c e me n t o f l i m b i c e p i l e p t o g e n e s i s in a d u l t r a t s ： m e c h a n i s t i c i n s i g h t s J P L o S O n e ， 2 0 1 1 ， 6 ( 9 ) ： e 2 4 0 3 3 Ma t o s GJ Ts a i R， Ba l d o M e t a 1 Th e s l e e p - wa k e c y c l e i n a d u l t r a t s f o l l o w i n g p i l o c a r p i n e i n d u c e d t e m p o r a l l o b e e p i l e p s y J E p i l e p s y B e h a 2 0 1 0 ， l 7 ( 3 ) ： 3 2 4 3 3 1 La d o F A, S p e r he r E F Mo s h e S L An t i c o n v u l s a nt e ffic a c y o f g a b a p e n t i n o n k i n d li n g i n t h e i m m a t u r e