利普斯他汀提取工艺及杂质的研究开题报告

河北科技大学工程硕士专业学位论文开题报告 课题名称：利普司他汀提取工艺及杂质的研究 姓 名: - 入学时间： 2015年9月 工程领域: 生物工程 所属学院: 生物科学与工程 学校导师: - 企业导师: - 说 明一、工程硕士专业学位研究生开题报告各项内容，要客观实际，逐条认真填写。表达要明确、严谨，外来语要同时用原文和中文表达。第一次出现缩写词，须注出全称。二、开题报告评议组由教授或具有硕士研究生指导教师资格的副教授组成，评议组成员一般不得少于五人，其中至少应有一位企业人员，并设一位组长。设记录员一位。三、题报告结束后，由评议组成员综合评议意见，写出具体评议结论。并由领域负责人审核签字后，报研究生学院备案。四、根据论文工作的最终研究结果，研究生所提交学位论文的题目可以在本开题报告的基础上有适当改动。五、本开题报告一式四份，校内导师、校外导师各一份，领域留一份，交研究生学院学位办一份备案（除签字部分外必须按A4纸打印），研究生学院不负责查询。河北科技大学工程硕士专业学位论文开题报告评审表姓名陈敏学校导师刘俊果企业导师李小兵工程领域生物工程开题时间2016、06、30第 1 次开题论文选题题目名称利普司他汀提取工艺及杂质的研究性质（）工程设计（）；技术研究（）；应用软件（）；工程管理（）项目来源（）企业项目（）； 部（省）项目（ ）； 国家项目（ ）；校企联合项目（ ）； 自拟项目（ ）。 评审组成员 姓 名 职 称工作单位及职务签字 - 教授 河北科技大学 - 教授 河北科技大学 - 教授 河北科技大学 - 教授 河北科技大学 - 教授 河北科技大学 - 教授 河北科技大学 - 教授 河北科技大学评审意见（含：选题意义；实验条件；技术方案可行性；研究计划合理性等）成 绩评审组长签字： 年 月 日领域负责人签字： 年 月 日注：1、成绩以“合格”“不合格”记；评审组成员为高级职称人员。 2、工程设计类包括：工程设计、建筑设计、产品设计、工艺设计、工业设计等； 技术研究类包括：应用基础研究、应用研究、预先研究、实验研究、系统研究等；应用软件类包括：系统软件、应用软件、数据库、网络等；工程管理类包括：工程管理、工程规划等1、 立论依据（所选课题的科学意义和应用前景，国内外研究现状分析，主要参考文献目录）：1、 课题的科学意义和应用前景利普司他汀（Lipstatin)作为脂肪酶抑制剂，是毒三素链霉菌(Streptomyces toxytricini)的次级代谢产物，能选择性抑制胃肠道中脂肪酶的活性，减少脂肪的分解和吸收，结构式如图所示，其四氢衍生物奥利司他（Orlistat)已被罗氏公司成功地开发为消化吸收阻滞型减肥药物，是目前唯一一个作为非中枢神经系统治疗肥胖症的药物，在为人们减轻体重的同时能有效的改善由肥胖症给人们带来的心血管等疾病的困扰，使其治疗有更好的安全性和耐受性。因此利普司他汀的研究具有广阔的应用前景和重要的科学意义。 利普司他汀（Lipstatin)结构式 2、国内外研究现状分析（1）对胰脂肪酶抑制剂的研究 1980年夏天,罗氏公司的科研人员采集到土壤样本；1981年4月,他们从3165个发酵罐中发现了1200株对胰脂肪酶有抑制作用的微生物,并且其中有一株微生物所产生的物质具有最大的活性和稳定性；1982年10月，利普司他汀（Lipstatin)被分离纯化，结构式被阐明；1993年4月，经过对利普司他汀（Lipstatin)的氢化，得到稳定的奥利司他（Orlistat)，并将其开发成减肥药物赛尼可（Xenical），是一种安全的全新肥胖治疗药物，在美国是唯一的减肥用药，目前占抗肥胖药物全球销售额的第一位。 （2）利普司他汀（Lipstatin)提取工艺的优化研究奥利司他（Orlistat)由罗氏公司原研，1999年被FDA批准上市，2007年被FDA批准为非处方药（OTC），目前占抗肥胖药物全球销售额的第一位，成为首只进入“重磅炸弹”行列的减肥药物。然而受工艺水平限制，不管是全合成工艺还是通过发酵中间体利普司他汀（Lipstatin)进行制备的半合成工艺，生产制备收率均不是特别理想，由此直接导致生产成本过高。 李小兵、赵平等人利用反向高效液相色谱制备高纯度奥利司他（Orlistat)，提高产品收率，简化工艺流程，降低运行成本。 彭平、郭萍等人将利普司他汀（Lipstatin)的有机溶剂萃取液进行浓缩，得到的浓缩物与C5-C20烷烃以及液态有机盐混合,过滤,得到滤液，再将滤液进行降温、结晶，得到利普司他汀（Lipstatin)。克服了现有技术设备成本高、耗能大、操作繁琐、一次处理量小等缺陷,降低了生产成本,提高了生产效率,适合工业化大生产。 赵志全、刘茂田研究了发酵法生产减肥药奥利司他（Orlistat)的制备新方法，通过发酵浸提液的大孔吸附树脂层析以及奥利司他（Orlistat)的硅胶柱层析等方法,达到良好的除杂、纯化产品的效果。 武汉奥多生物医药有限公司有一套完整的利普司他汀（Lipstatin)提取工艺，如下提取工艺物料衡算图所示，将40吨发酵液经预处理后进行两次板框过滤，得到的10吨湿菌丝体在75%的乙醇中进行浸提，浸提液进行大孔树脂吸附，除去含有的葵花油和发酵过程中产生的部分杂质，可得到56m3的洗脱液，加入10m3的正庚烷进行萃取浓缩，可得到正庚烷浓缩液660kg，上硅胶柱层析，进一步除去代谢过程中产生的杂质，将得到的600kg硅胶浓缩液进行结晶、过滤，最终得到利普司他汀（Lipstatin)成品浓缩液195240kg。 虽然该公司的提取纯化工艺能使利普司他汀（Lipstatin)的色谱纯度达到88.0-92.0%，但是在进行大孔吸附时每40吨的发酵液将产生182.6m3的废乙醇，56m3的废水，尽管废乙醇可以进行回收再利用，但运行成本过高，并且易燃易爆，不适合工业化生产，故需进一步改善提取工艺。在查阅了大量的参考文献和学习了前人的成果后，并对分离提取的实验进行了系统的学习，为了最大化减少乙醇浪费，适合工业化生产，在原有的基础上将乙醇浸提液直接进行正庚烷萃取、浓缩，将得到的正庚烷浓缩液加入乙腈在20，冷冻5-6h除去葵花油，再进行浓缩，由甲醇溶解上硅胶柱层析。此工艺的改进在降低生产成本的同时，依旧能达到较高的色谱纯度，为以后的解谱确定各杂质结构工作打下坚定的基础。利普司他汀（Lipstatin)提取工艺物料衡算图上柱液64m3浸泡液56m3湿菌丝10吨发酵液40吨 正庚烷浓缩液660kg正庚烷萃取液10m3(废乙醇79.4M3)洗脱液56m3(废乙醇103.2m3废水56m3) ) 利普司他汀粗品结晶液约3.4m3硅胶浓缩液600kg硅胶上柱液4m3 利普司他汀（Lipstatin)成品结晶液2.8m3利普司他汀成品浓缩液195240kg(废己烷约2.7m3)利普司他汀粗品250280kg（废己烷约3.2m3) 3、主要参考文献目录1 Schuhr CA, Eisenreich W, Goese M, et al. Biosynthetic precursors of the lipase inhibitor lipstatinJ. J Org Chem, 2002, 67(7): 2257-2262.2 S.多斯沃德，E.库普菲，G.斯坦鲍尔，等.一制胰酯菌素的的提纯方法 P.ZL200510094601.4,2005.09.293 Weibel EK,Hadvary P,Hochuli E,et al.Lipstatin,an inhibitor of pancreatic lipase, produced by Streptomyces toxytricini. I. Producing organism, fermentation, isolation and biological activityJ.J Antibiot (Tokyo),1987,40(8): 1081-1085.4 李小兵，李思琦，焦彦凯等.高纯度奥利司他的制备与放大J.中国抗生素杂质，2014,39（3）： 210-213. 5 胡为民. Lipstatin 发酵及提取工艺D. 上海：华东理工大学生物工程学院，2006.6 Clarke NJ，indgen D，Korfmacher WA，et alSystematic LC /MS metabolite identification in drug discoveryJAnal Chem，2001，73(15): 430A7 AnneB, StevenRP.Orlistat: its currentstatus as an anti-obesity drugJ. Euro J Pharmaco, 2002, 440(1): 109-117.8 徐勇煌,彭韪,唐彬喜,等.一种奥利司他的制备方法P.CN201110047178.8,2011,02,28. 9 赵志全，刘茂田.一种生产制备奥利司他的方法P.CN201010505171.1，2010，10，13. 10 Goese M, Eisenreich W, Kupfer E et al. Biosynthesis of lipstatin. Incorporation of multiply deuteriumlabeled (5Z,8Z)-tetradeca-5,8-dienoic acid and octanoic acid. J Org Chem. 2001,66(13):4673-4678. 11 Demirev AV, Khanal A, Sedai BR et al. The role of acyl-coenzyme A carboxylase complex in lipstatin biosynthesis of Streptomyces toxytricini. Appl Microbiol Biotechnol. 2010, 87(3):1129-1139.12 谭晓世，王栋海，王晏，等.毒三素链霉菌发酵产物中有关物质的结构鉴定 J.江苏药学 与临床研究，2006,14（3）：176177.13 朱国荣 ，应雪肖，邓传亮，等一种提纯奥利司他的方法:中国，200910169508.3 P .2009 090814 Goese M，Eisenreich W，Kupfer E，et al Biosynthetic origin of hydrogen atoms in the lipase inhibitor lipstatin J .The Journal of Biological Chemistry,2000,275( 28): 21 19221 19615 Souri E, Jalalizadeh H, Kebriaee-Zadeh A, et al. HPLC analysis of orlistat and its application to drug quality control studiesJ.Chem Pharm Bull( Tokyo),2007,55(2): 251-254.16 石其德，朱骊安，蒋俊云，等.奥利司他原料药制备过程中的杂质分析J.中国药业，2013,22 （2）：210-213. 17 Schuhr CA, Eisenreich W, Goese M et al. Biosynthetic precursors of the lipase inhibitor lipstatin. J Org Chem. 2002, 67(7):2257-2262.18 Sanchez S, Demain AL. Metabolic regulation and overproduction of primary metabolites. Microb Biotechnol. 2008,1(4):283-319. 2、 研究内容，预期目标或成果（具体说明课题研究内容，要重点解决的关键问题和本课题所要达到的目标或要取得的成果）： 1、研究内容：（1）走通新工艺，利普司他汀（Lipstatin)色谱纯度达88.0%92.0%。（2）高压制备,分离得到46个杂质单体。（3）对各杂质单体、利普司他汀（Lipstatin)样进行LC/MS检测，结合利普司他汀（Lipstatin)生物合成途径，解谱确定各杂质结构。（4）根据解谱后的各杂质结构，进一步研究利普司他汀的生物合成途径。2、重点解决的关键问题：（1）走通新工艺，达到较高的色谱纯度。（2）结合利普司他汀（Lipstatin)的生物合成途径，进行LC/MS检测，解谱确定各杂质结构。 3、预期目标：（1）查阅大量文献了解利普司他汀（Lipstatin)的生物合成途径；走通新工艺使色谱纯度达到88.0%-92.0%；解谱确定各杂质结构。（2）发表论文一篇。3、 拟采用的研究方法、技术路线、试验方案、可行性分析及研究进度安排：研究方法：1.在原有工艺的基础上去掉大孔树脂吸附，降低成本，增加乙腈除油工艺。2.高压制备，分离46个杂质单体。3.查阅大量文献，结合利普司他汀（Lipstatin)的生物合成途径，并将利普司他汀样进行LC/MS检测，解谱确定各杂质结构。4.根据杂质结构，进一步研究生物合成途径。试验方案： 将利普司他汀（Lipstatin)发酵液进行预处理，加入85%左右的乙醇超声破碎30min,得到浸提液，加入正庚烷萃取两次除去部分杂质，浓缩后加入乙腈-20，冷冻5-6h除去葵花油，浓缩后由正庚烷溶解上硅胶柱层析进一步除去代谢过程中产生的杂质，将得到的硅胶浓缩液进行结晶、过滤，最终得到利普司他汀（Lipstatin)成品浓缩液。 技术路线：利普司他汀发酵液过滤乙醇浸提乙腈除油正庚烷萃取浓缩 浸提液浓缩色谱分析杂质分析硅胶层析可行性分析：1.本实验室有利普司他汀（Lipstatin)发酵液。2.萃取、浓缩结晶、硅胶层析技术广泛应用在分离提取工艺中。3.本人已查阅了大量的参考文献，根据前人的成果，并对分离提取的实验操作及理论基础知识进行了系统的学习巩固。研究进度安排：2016.03.012016.05.01：查阅相关参考文献，实验的前期探索。2016.05.012016.09.01：在原有工艺的基础上去掉大孔树脂吸附，增加乙腈除油工艺。2016.09.012016.12.01：对提纯后的利普司他汀进行色谱分析，使色谱纯度达88.092.0%。2017.03.012017.06.01：对各杂质单体进行、利普司他汀（Lipstatin)样品进行LC/MS检测，结合利普司他汀（Lipstatin)生物合成途径，解谱确证各