荧光显微镜的基本原理.ppt

高分辨率荧光显微镜的基本原理和操作要求,光学显微镜的基本参数,主要技术参数 数值孔径NA,荧光显微镜(fluorescence microscope)： 某些物质经一定波长的光（如紫外光）照射后，物质中的分子被激活，吸收能量后跃迁至激发态；当其从激发态返回到基态时，所吸收的能量除部分转化为热量或用于光化学反应外，其余较大部分则以光能形式辐射出来，由于能量没能全以光的形式辐射出来，故所辐射出的光的波长比激发光的要长，这种波长长于激发光的可见光部就是荧光(fluorescence)。所谓荧光就是某些物质在一定波长光（如紫外光）的照射下、在极短时间内所发出的比照射光波长更长的可见光。,Figure 9-14 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008),The maximum excitation and emission wavelengths of several commonly used fluorescent probes are shown in relation to the corresponding colors of the spectrum.,荧光显微镜的组成 1、光源：一般采用高压汞灯 2、滤色系统：由激发滤板和压制滤板组成 a、激发滤板：提供一定范围的激发光 b、压制滤板：完全阻挡激发光通过，提供相应滤长范围的荧光 3、反光镜：一般采用平面反光镜 4、聚光镜：用石英玻璃或其他透紫外光的玻璃制成 5、物镜和目镜,The optical system of a fluorescence microscope. A filter set consists of two barrier filters (1 and 3) and a dichroic mirror (beam-splitting 2),荧光染料的使用,1、吖啶橙：吖啶橙是最经典的灵敏的荧光染料，它可对细胞中的DNA和RNA同时染色而显示不同颜色的荧光，DNA呈绿色荧光，RNA呈橙红色荧光。 2、溴化乙锭（EB）:染色DNA和RNA。 3、荧光素双醋酸酯(FDA)：FAD 本身无荧光,无极性,可透过完整的原生质膜。一旦进入原生质体后,由于受到酯酶分解而产生 具有荧光的极性物质荧光素。 4、荧光染料Ho33342和罗丹明123:Ho33342能与细胞中DNA进行特异的结合，罗丹明123能与线粒体进行特异的结合。,荧光组化实验中应注意的几个问题,1、每种荧光染料，均有自己的最适pH值，此时荧光最强。当pH改变时，不仅荧光强度减弱，而且波长将有所改变，因此荧光检测时要在一定的pH值的缓冲液中进行。 2、一放荧光染色在20。C以下时荧光比较稳定，温度升高常出现温度猝灭。 3、在荧光观察中，常因激发光的增强而使样品荧光很快衰竭，造成观察和照相困难。为此最好用能量小的长波长光进行观察，需照相时再适当增强激发光。 4、一般荧光染液的浓度在万分之一以下，甚至亿万分之一，也能使标本着色。在一定的限度内，荧光强度可随荧光素的浓度增加而增强，但超过限度，荧光强度反而下降，这是由于荧光分子间的缔合而使自身荧光猝灭所致。,注意事项： 1 暗室内进行，打开汞灯5-10min稳定后再观察。 2 荧光淬灭(光漂白)：激发光长时间照射会发生荧光减弱或消失，操作时注意及时用挡板阻挡激发光照射标本。 3 汞灯关闭后需冷却30min后再重新启动（最好不要短时间内反复开