多重PCR 检测金黄色葡萄球菌六型肠毒素基因的研究.doc

多重PCR检测金黄色葡萄球菌六型肠毒素基因的研究刘继超，姜铁民，姜阿赤，陈历俊*（北京三元食品股份有限公司，北京100076）摘要：目的：为了建立一种简单、快速检测金黄色葡萄球菌六型肠毒素基因的多重PCR方法。方法：根据相关文献和Genebank报道的编码金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C、D、E、H的基因序列，选择合成了6对特异性引物，建立多重PCR体系，并对反应条件进行了优化。结果：6对引物能同时特异地扩增出120bp、478bp、257bp、319bp、170bp和375bp的目的片段，表明6对引物具有良好的特异性。结论：本研究成功地建立了一种同时检测金黄色葡萄球菌六型肠毒素基因的多重PCR方法，在金黄色葡萄球菌肠毒素快速筛查方面具有良好的应用前景。关键词：多重PCR；检测；金黄色葡萄球菌；肠毒素AstudyonfastdetectionofsixkindsofStaphylococcusaureusenterotoxinsgeneswithamultiplexPCRmethodLIUJi-chao,JIANGTie-min,JIANGA-chi,CHENLi-jun*(BeijingSanyuanFoodsCo.Ltd.,Beijing,100076)Abstract:Objective:ToestablishamultiplexPCRmethodfordetectingSEA,SEB,SEC,SED,SEEandSEHgenesofStaphylococcusaureusfastandhighlyeffectively.Methods:AccordingtoSEA,SEB,SEC,SED,SEEandSEHgenesequencesofStaphylococcusaureusinGenBankandrelevantliteratures,sixpairsofspecificprimershadbeendesigned.EstablishedmultiplexPCRmethodsanditsreactionconditionswereoptimized.Results:Undertheoptimizedconditions,thesixfragmentsof120bp,478bp,257bp,319bp,170bpand375bpweresimultaneouslyamplifiedfromsixcoupleprimers.TheresultsshowedthatthePCRofsixpairsprimersweregoodspecifity.Conclusions:Asimple,rapidandsensitivemultiplexPCRmethodfordetectingsixkindsofS.aureusenterotoxingeneshasbeenestablished.ItcoulddetectSEA,SEB,SEC,SED,SEEandSEHgenessimultaneously,therefore,theprospectoffastdetectionofStaphylococcusaureusenterotoxinisbrilliant.Keywords:multiplexPCR,detection,Staphylococcusaureus,enterotoxin金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，SA)，是国内外最常见的细菌性食物中毒病原体之一，该菌引起食物中毒的主要原因是产生葡萄球菌肠毒素(staphylococcalenterotoxins，SEs)。根据其血清学特性，SEs可分为5型(SEA、SEB、SEC、SED、SEE)，近几年还报道了SEG、SEH、SEI、SKJ、SEK、SEL、SEM、SEN和SEO、SEP、SEQ、SER、SET、SEU等新分型的肠毒素1-4。目前国内外通讯作者：陈历俊，基金项目：“十一五”国家科技支撑计划(2009BADB9B06)；北京市重点科技计划项目(D1011050460000)作者简介：刘继超，男，1983年出生，硕士，乳品微生物。用于检测SEs的方法按照检测原理的不同，可分为生物学检测方法、免疫血清学方法、聚合酶链反应技术、生物传感器技术及超抗原技术等5-6。这些方法都存在一个问题：即一次实验只能检测一种病原菌。如采用多重PCR检测，则既具有PCR简便快速的特点，又能在同一反应体系中同时检测多种SEs。本研究针对金黄色葡萄球菌肠毒素的6种血清型(A、B、C、D、E、H型)设计选择特异性PCR引物，进行多重PCR检测，建立一种快速一次性检测6种肠毒素血清型的多重PCR检测方法。1材料与方法1.1材料1.1.1菌种标准菌株(见表1)分别购自中国药品生物制品检定所菌种保藏中心、中国微生物菌种保藏中心、中国兽医药品监察所和美国模式培养物集存库(ATCC)。表1试验用标准菌株Table1Teststandardstrains菌名菌种编号金黄色葡萄球菌肠毒素AATCC-13565金黄色葡萄球菌肠毒素BATCC-14458金黄色葡萄球菌肠毒素CATCC-19095金黄色葡萄球菌肠毒素DATCC-23235金黄色葡萄球菌肠毒素EATCC-27664金黄色葡萄球菌肠毒素HATCC-51811单增李斯特菌ATCC-15313大肠杆菌ATCC-25922金黄色葡萄球菌CGMCC-1.0128沙门氏菌CGMCC-1.1552表皮葡萄球菌CGMCC-1.24291.1.2试剂溶菌酶、RNaseA、EDTA、SDS、NaCl、无水乙醇、苯酚、氯仿、异戊醇等均为国产分析纯；琼脂糖(SpainAgarose香港基因公司分装)；TaqDNA聚合酶、dNTPs购自北京全式金生物技术有限公司；PCR染料、DNAMarkerB购自北京赛百盛基因技术公司。1.1.3仪器GeneAmpPCRSystem2400PCR仪(美国PE公司)，PAC300电泳仪(BIO-RAD公司)，TanonGIS2010凝胶成像仪(上海天能科技有限公司)，离心机2K15(Sigma)，ThermopH计(美国)，LRH-250生化培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)。1.2方法1.2.1模板DNA的提取在无菌条件下，用灭菌处理的接种环分别挑取试验用标准菌落，接种于5ml营养肉汤培养基中，37培养过夜后培养基出现明显混浊，即培养基中有大量菌体增殖。使用培养好的菌液进行金黄色葡萄球菌基因组DNA的提取，提取菌体DNA方法见参考文献7-8。1.2.2扩增引物设计参考有关文献9-14设计选择SEA、SEB、SEC、SED、SEE、SHE的PCR引物，引物的序列及目的产物长度见表2。表2多重PCR引物的序列及目的产物长度Table2BasesequencesofthemultiplexPCRspecificoligonucleotideprimersandpredictedsizesofamplifiedproducts基因引物引物序列长度(bp)产物长度（bp）seaSEA-FTTGGAAACGGTTAAAACGAA20120SEA-RGAACCTTCCCATCAAAAACA20sebSEB-FTCACATCAAACTGACAAACG20478SEB-RGCAGGTACTCTATAAGTGCC20secSEC-FGACATAAAAGCTAGGAATTT20257SEC-RAAATCGGATTAACATTATCC20sedSED-FCTAGTTTGGTAATATCTCCTTTAAACG27319SED-RTTAATGCTATATCTTATAGGGTAAACATC29seeSEE-FTAGATAAAGTTAAAACAAGC20170SEE-RTAACTTACCGTGGACCCTTC20sehSEH-FCATTCACATCATATGCGAAAGCAG24375SEH-RCATCTACCCAAACATTAGCACC221.2.3多重PCR体系的建立利用从标准菌株中所提取的基因组DNA作为模板，通过每对引物单独扩增其目的基因的常规PCR，尽量找出共同条件，统一条件后进行混合引物扩增多个模板的多重PCR，并摸索最佳反应条件。多重PCR反应体系为：模板DNA：6l(六种菌株DNA各1l)；25mol/l上下游引物：6l(六对引物各1l)；2.5mol/ldNTPs：3l；5U/lTaq酶：1.5l(5U/l)；10PCRBuffer：5l；PCR染料：5l，用无菌超纯水补充至总体积50l。离心混匀后置PCR仪上进行自动化扩增反应，循环参数为94预变性4min；94变性1min；50退火45s；72延伸1min；共35个循环；最后72延伸10min，4保存。1.2.4特异性试验分别用每对引物扩增其目的菌株及表1中其它所有菌株，观察各对引物的特异性。同时应用6对引物扩增表1中的所有菌株，观察多重PCR条件下引物的特异性并摸索最佳反应条件，然后对PCR扩增产物进行电泳检测。2结果与分析2.1多重PCR特异性分析以提取的6种目标菌株DNA为模板，另外分别以沙门氏菌、无乳链球菌、金黄色葡萄球菌提取的单一DNA为模板，同时加入6对引物进行扩增(见图1)。结果表明，对照组金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、沙门氏菌、大肠杆菌、表皮葡萄球菌及阴性对照均没有扩增现象，扩增结果见图1。表明6对多重PCR引物对于扩增金黄色葡萄球菌肠毒素的6种血清型(A、B、C、D、E、H)具有较好的特异性。图1多重PCR特异性分析Fig1SpecificityofmultiplexPCRanalysisM：DNAMarkerB；1：多重PCR的扩增产物；2：SEA的扩增产物120bp；3：SEB的扩增产物478bp；4：SEC的扩增产物257bp；5：SED的扩增产物319bp；6：SEE的扩增产物170bp；7：SEH的扩增产物375bp；8：金黄色葡萄球菌；9：表皮葡萄球菌；10：单增李斯特菌；11：大肠杆菌；12：沙门氏菌；13：阴性对照2.2多重PCR反应条件的优化PCR反应的影响因素很多，其中1个重要参数就是退火温度，其次还有Mg2+浓度、循环数等。首先利用PCR仪优化退火温度，在最佳的退火温度下再根据条带的亮暗调整Mg2+浓度，同时调整循环数，以便在最短的时间内达到最佳的效果。2.2.1退火温度的优化设置退火温度梯度：46、47、48、49、50，使用3.0%的琼脂糖凝胶电泳的结果见图2。多重PCR的六条目的带在退火温度为48间时亮度最佳，故多重PCR的最佳退火温度为48。图2多重PCR退火温度梯度结果Fig2TheresultsofmultiplexPCRannealingtemperaturegradientM：DNAMarkerB；1：退火温度为46；2：退火温度为47；3：退火温度为48；4：退火温度为49；5：退火温度为502.2.2Mg2+浓度的优化设置Mg2+浓度梯度为1.5mM、2.0mM、2.5mM、3.0mM，电泳结果见图3。Mg2+浓度为2.0mM时多重PCR的目的带较好，故选Mg2+的最佳浓度为2.0mM。图3Mg2+浓度梯度结果Fig3TheresultsofMg2+concentrationgradient1：Mg2+浓度为1.5mM；2：Mg2+浓度为2.0mM；3：Mg2+浓度为2.5mM；4：Mg2+浓度为3.0mM；M：DNAMarkerB；2.2.3循环数的优化设置循环数梯度为32、35、38，电泳结果见图4，可知循环数为35时的目的带最好，故最佳循环数为35。图4循环数梯度结果Fig4Theresultsofcyclesgradient1：循环数为32；2：循环数为35；3：循环数为38；M：DNAMarkerB3结论根据genebank报道的编码金黄色葡萄球菌肠毒素A、B、C、D、E、H的基因序列，设计了6对PCR引物，目的片段的长度分别为120bp、478bp、257bp、319bp、170bp和375bp。多重PCR扩增结果表明6对PCR引物具有良好的特异性，并多重PCR反应条件的优化，优化结果为最佳退火温度48、Mg2+的最佳浓度2.0mM、最佳循环数35。本研究成功地建立了简单、快速的多重PCR方法，可以一次性检测金黄色葡萄球菌六型肠毒素基因，在金黄色葡萄球菌肠毒素快速筛查方面具有良好的应用前景。参考文献1ZschockM,KloppertB,WolterW,etal.Patternofenterotoxingenesseg,seh,seiandsejpositiveStaphylococcusaureusisolatedfrombovinemastitisJ.VetMicrobiol,2005,108:243249.2LovsethA,LoncarevicS,BerdalKG.ModifiedmultiplexPCRmethodfordetectionofpyrogenicexotoxingenesinstaphylococcalisolatesJ.JClinMicrobiol,2004,42:38693872.3OmoeK,IshikawaM,ShimodaY,etal.Detectionofseg,seh,andseigenesinStaphylococcusaureusisolatesanddeterminationoftheenterotoxinproductivitiesofS.aureusisolatesHarboringseg,seh,orseigenesJ.JClinMicrobiol,2002,40(3):857-862.4RosecJP,GigaudO.StaphylococcalenterotoxingenesofclassicalandnewtypesdetectedbyPCRinFranceJ.IntJFoodMicrobiol,2002,77(1-2):61-70.5李红云，施志国，姚咏明.金黄色葡萄球菌肠毒素和中毒性休克毒素检测的研究进展J.国外医学临床生物化学与检验学分册，2000，21(5)：247251.6向阳.食品中金黄色葡萄球菌及其肠毒素的检测方法J.中国食品学报，2002，2(2)：57-61.7J.S.Moon,A.R.Lee,H.M.Kang,etal.AntibiogramandCoagulaseDiversityinStaphylococcalEnterotoxin-ProducingStaphylococcusaureusfromBovineMastitisJ.JournalofDairyScience,2007,90(4):1716-1724.8SudhirTamarapu,JohnLMc,etal.DevelopmentofaMultiplexPolymeraseChainReactionAssayforDetectionandDifferentiationofStaphylococcusaureusinDairyProductsJ.JFoodProt,2001,64(5):664-668.9W.M.Johnson,S.D.Tyler,E.P.Ewan,etal.DetectionofGenesforEnterotoxins,ExfoliativeToxins,andToxicShockSyndromeToxin1inStaphylococcusaureusbythePolymeraseChainReactionJ.JournalofClinicalMicrobiology,1991,29(3):426430.10SophieJarraud,GregoireCozon,FrancoisVandenesch,etal.InvolvementofEnterotoxinsGandIinStaphylococcalToxicShockSyndromeandStaphylococcalScarletFeverJ.JournalofClinicalMicrobiology,1999,37(8):24462449.11ManishaMehrotra,GehuaWang,WendYM.Johnson.MultiplexPCRforDetectionofGenesforStaphylococcusaureusEnterotoxins