结核分支杆菌特异性抗原重组蛋白MPT63 检测系统的建立.doc

结核分支杆菌特异性抗原重组蛋白MPT63检测系统的建立程国平李克生张润玲【摘要】目的建立规范的结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis,MTB)特异性抗原重组蛋白MPT63酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbentassay,ELISA)检测系统。方法采用方阵法确定蛋白包被浓度和酶标二抗浓度，以ROC（ReceiverOperatingCharacteristic）曲线法确定MPT63蛋白ELISA法检测的cut-off值。探讨规范的ELISA检测系统建立的方法。结果ELISA检测系统MPT63蛋白包被浓度1128000，酶浓度11000时为最佳；在cut-off值为0.35-0.4时检测MPT63蛋白抗体的灵敏度和特异性最为理想，分别是75%和78.6%。结论用方阵法确定蛋白包被浓度和酶标二抗浓度，并以ROC曲线法确立cut-off值是建立规范化的ELISA检测系统的关键环节。关键词重组蛋白MPT63；ELISA；ROC曲线；cut-off值EstablishmentdetectionsystemofrecombinationproteinMPT63onmycobacteriumtuberculosisspecificantigenCHENGGuo-ping,DepartmentofClinicalLaboratory,TheFirstAffiliatedHospitalofHenanUniversityofScienceandTechnology,Henan471000,ChinaLIKe-shengMedicalScienceResearchInstituteofGansuprovinceBiotechnologyCenter，ZhangRun-lingTheoriginalDepartmentofClinicalLaboratory,TheSecondAffiliatedHospitalofLanzhouUniversityLaboratory【Abstract】ObjectiveTosetupastandardtestingsystemofmycobacteriumtuberculosisspecificantigen-recombinatedMPT63proteinbyenzyme-linkedimmunosorbentassaymethod.MethodsThesquarematrixmethodisusedtodeterminetheconcentrationofcoatedproteinandtheconcentrationofenzymelabelingantibody.ReceiverOperatingCharacteristicmethodisusedtodeterminethecut-offvalueofELISAdetectedMPT63protein.ToapproachaestablishmentofstandardELISAdetectionsystem.ResultsELISAdetectedMPT63proteinmayattainhighersensibilityandspecificitywhenthecoatedproteinisdilutedaccordingto1128000andtheenzymelabelingantibodyisdilutedby11000.ConclusionsThecriticalelementsinELISAdetectionsystemaretheapplicationofsquarematrixmethodtodeterminetheconcentrationofcoatedproteinandtheconcentrationofenzymelabelingantibodyandapplicationtheROCtodeterminecut-off.KeywordsRecombinationproteinMPT63；ELISA；ROC；Cut-off；结核病（TB）已成为我国乃至世界危害最严重的疾病之一1，2000年第四次1作者单位：471000河南科技大学第一附属医院检验科（程国平）；甘肃省医学科学研究院生物技术中心（李克生）；原兰州大学第二附属医院检验科（张润玲）全国结核病流行病学抽样调查发现,我国感染人数5.5亿，活动性肺结核人数600万，死亡人数25万。但是目前对结核病早期快速准确的诊断是临床工作的难点,制约结核病的治疗和感染的控制。寻找一种快速、准确和实用的结核病感染的诊断方法乃是当务之急。随着致病性结核杆菌全基因组的测序工作完成2，应用双向电泳、质谱及生物信息学技术开展的结核杆菌蛋白质组学研究，多种结核分支杆菌特异性蛋白抗原不断被发现3，为结核病血清学检测奠定了基础。血清学检测中，ELISA以其灵敏,简单，快速和廉价等特点在临床检验方面被广泛应用。本文以结核分枝杆菌特异性蛋白MPT63为抗原，探讨建立规范的检测其抗体的ELISA检测系统。1材料与方法1.1标本来源本实验阳性和阴性对照血清由甘肃省医学科学院提供；另外，收集2008年1月至2010年5月甘肃省肺科医院按照结核病诊断标准4确诊为肺结核的患者血清，男性50例，年龄15-72岁；女性48例，年龄16-68岁；健康对照为健康体检者98例：男性53例，年龄20-68岁；女性45例，年龄18-65岁。采集空腹静脉血液3mL,立即分离血清储存于-70备用。1.2试剂MTB特异性抗原重组MPT63蛋白由中国药品生物制品鉴定所惠赠；辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG购自北京中山生物公司；蛋白Marker为普利莱公司产品。1.3仪器酶标仪（芬兰产Thermolabsystems的MultiskanMK3）；洗板机（芬兰产Thermolabsystems的MultiskanMK3）；蛋白测量仪；琼脂糖凝胶电泳仪（法国西比亚）。2方法2.1MPT63蛋白的测定。蛋白测量仪测得MTB特异性抗原重组蛋白MPT63在260nm和280nm波长的OD值,依据公式:蛋白含量=OD2801.45+OD2600.74(mg/ml)计算出蛋白含量。琼脂糖凝胶电泳观察MPT63蛋白的纯度并检测其分子量。2.2用方阵的方法选择ELISA检测系统的抗原包被浓度和酶标浓度。包被液（PH9.6）稀释MPT63蛋白分别为：12000；4000；8000；16000；32000；64000；128000；256000八个浓度梯度，包被聚苯乙烯微孔板，置于4冰箱过夜；用含2.5%胎牛血清白蛋白和2.5%酪蛋白封闭液封闭微孔板，37孵育2h，干燥过夜，装铝箔袋，封口备用；用样本稀释液按120比例稀释混合阳性血清和混合阴性血清,加入包被好的微孔板，37孵育0.5h；洗板机洗6次，将羊抗人IgG标记的辣根过氧化物酶稀释成1500；750；1000；1500；2000；3000六个浓度梯度即如微孔板，37孵育0.5h；洗板机洗6次。加入邻苯二胺酶的底物溶液孵育,2MOL/lH2SO4终止反应。酶标仪波长450nm处测OD值。以灵敏度为纵坐标；假阳性率(1-特异性)为横坐标绘制各个抗原包被浓度和各个酶浓度下的ROC曲线，比较获得最佳的抗原包被浓度和酶浓度。2.3以ROC曲线确定ELISA检测系统的cut-off值。以上述选择的最佳抗原包被浓度包被微孔板和最佳的酶标浓度检测98份阳性血清标本和98份血清阴性标本的吸光度（OD），以ROC曲线描述此检验方法的灵敏度与假阳性率之间的关系。曲线下面积最大时的灵敏度与特异性的点对应的OD值就是该抗原检测的cut-off值，待测标本OD该cut-off值为阳性,待测标本OD该cut-off值为阴性。3结果3.1重组MPT63蛋白浓度为：4.172mg/ml,分子量16000。3.2不同包被抗原浓度与酶浓度下，检测的OD值见表1。比较不同包被抗原浓度的ROC曲线得出：MPT63蛋白在包被浓度1128000时可使测定得到好的灵敏度和特异性5，见图1。比较不同酶浓度的ROC曲线得出：酶浓度11000时可使测定得到好的灵敏度和特异性5，见图2。表1不同包被抗原浓度与酶浓度的检测OD值酶浓度包被抗原浓度120001400018000116000132000164000112800012560001：500+-0.110.150.330.160.230.250.180.120.270.190.390.280.560.390.70.711750+-0.370.240.190.130.180.290.150.180.210.140.330.180.420.240.470.3411000+-0.540.340.70.290.730.350.540.280.570.330.520.360.58*0.150.640.2311500+-0.30.190.270.140.310.150.320.150.460.300.340.170.740.300.660.5712000+-0.270.190.220.130.190.10.450.10.130.130.290.200.320.300.720.5513000+-0.120.130.130.420.130.040.150.020.250.140.140.080.250.20.350.39注：*为重组MPT63蛋白ELISA检测系统的最佳抗原包被浓度和酶浓度所对应cut-off值。图1抗原包被浓度1128000反应曲线图二酶浓度11000反应曲线3.3根据假设的不同cut-off值区间，计算各区间的灵敏度和特异性，见表2，所对应的ROC曲线见图3。由图3可看出ELISA检测MPT63蛋白，在灵敏度75%和特异性78.6%时的点曲线下面积最大，此点所对应的cut-off值为0.35-0.4。表2不同cut-off值检测的灵敏度和特异性OD界值特异性灵敏度OD界值特异性灵敏度0-0.0501000.7-0.7510019.120.05-0.117.861000.75-0.810014.760.1-0.1532.1497.060.8-0.8510014.710.15-0.25094.120.85-0.910013.240.2-0.2564.2989.710.9-0.9510011.770.25-0.371.4382.350.95-110010.290.3-0.357577.941-1.051007.350.35-0.478.57751.05-1.11007.350.4-0.4582.1463.241.1-1.151004.410.45-0.589.2951.471.15-1.21002.940.5-0.5592.8642.651.2-1.251002.940.55-0.692.8632.351.25-1.31001.470.6-0.6596.4330.881.3-1.351001.470.65-0.710020.591.35-1.41001.47图3抗原包被浓度1128000与酶浓度11000时反应曲线cut-off值为灵敏度75%、特异性78.6%的点所对应的OD值即0.35-0.44讨论：4.1在ELISA抗原固相化过程中，蛋白抗原通过疏水性相互作用吸附于聚苯乙烯等固相表面，这种非共价被动吸附过程中,由于蛋白吸附于固相的随意性，吸附于固相表面的蛋白结构可能由于折叠、功能行结合部位朝向固相等而发生严重的改变。此外，在固相的不同位点它们与固相的结合程度也有差异，结合疏松的容易发生脱吸附（测定中68%被动吸附的抗原或抗体可能会发生脱吸附）。脱吸附的抗原或抗体会成为免疫反应中的竞争物，从而导致免疫测定的精密度降低5。以最适浓度固相化抗原或抗体是减少这种影响的简单、有效措施，而以最适浓度固相化抗原，正是本试验的核心环节之一。4.2在抗原或抗体的被动吸附包被过程中，不管加入的抗原或抗体的量多大，聚苯乙烯塑料表面吸附的最大限度为1.5ng/mm2，占整个固相表面的1/3，处于次限度的抗原或抗体蛋白分子均匀分布。一旦包被用抗原或抗体蛋白过量，由于蛋白-蛋白的相互作用叠集而致固相上多层蛋白的形成，则会出现大于固相最大结合限度的吸附，这种因蛋白间的相互作用而形成的次级吸附很不稳定，从而干扰免疫测定5。因此本试验采用八个包被抗原浓度梯度，比较发现，当抗原包被浓度在1128000时，其实际包被抗原的含量为3.2g/ml,较其他七个包被浓度灵敏度和特异性相对高。这与文献5报道的：用于包被抗原或抗体的理想浓度通常在110g/ml之间也相吻合。以六个酶浓度梯度调试，得出了相对最为合适的MPT63蛋白ELISA检测的酶浓度。此MPT63蛋白ELISA检测系统科学的的保证了抗原以适当的浓度包被于固相载体；参与反应的酶适量。因此，最大限度避免了常见的包被抗原蛋白叠集和所用酶不适量的情况。4.3目前国内以ELISA为研究方法的大多采用测定标本对阴性比值法(testtonegativeratio,TNR)：假定在每批测定中包含大量的阴性控制样本,于是每份测定标本均可以与阴性控制样本值的中值的比值来表示,设标本的测定值为Y,阴性对照值的中值为M,一般将Y/M2或3定为阳性，cut-off值计算公式为2或3（阴性对照值的中值），这种设定方法对避免假阳性结果的出现较好，但假阴性可能比例较高，该方法是一种粗糙的cut-off值设定方法5。4.4结核分枝杆菌特异性抗原MPT63蛋白是结核分枝杆菌的重要抗原之一，以ROC曲线法建立MPT63蛋白系统，为结核分枝杆菌其他抗原建立规范的ELISA检测提供了理论依据和尝试。目前研究已经发现了多种结核分枝杆菌特异性抗原蛋白，联合多种抗原进行检测，在保证特异性的基础上有助于提高诊断的敏感性。如果均能采取这种规范的方法，建立起各个