南方红豆杉水提物对人肺癌A549 细胞增殖抑制作用的研究.doc

南方红豆杉水提物对人肺癌A549细胞增殖/抑制作用的研究舒琦瑾1李萍2王彬彬1朱国猛1（1浙江中医药大学附属第一临床医学院肿瘤科，杭州310006；2杭州师范大学附属医院肿瘤科，杭州310015）摘要：目的研究南方红豆杉水提物对人肺癌A549细胞增殖的抑制作用和机制。方法采用MTT法检测南方红豆杉水提物对A549细胞增殖的抑制作用；生长曲线法观察其抑制A549细胞的时间-效应曲线；流式细胞仪检测其对A549细胞周期及凋亡的影响；倒置显微镜及电镜观察其对A549细胞形态的影响。结果南方红豆杉水提物对A549细胞的增殖有抑制作用；其抑制作用机制为使A549细胞周期出现明显的G0/G1期阻滞，诱导细胞凋亡。结论南方红豆杉水提物对人肺癌A549细胞的增殖有抑制作用。主题词：南方红豆杉；抑制作用；人肺癌A549细胞；细胞增殖StudyonInhibitoryActionofProliferationofhumanlungcarcinomaA549CellwithaqueousextractofTaxuschinensisShuQi-jin1,LiPing2,WangBin-bin1,ZhuGuo-meng11.DepartmentofOncology,theFirstAffiliatedHospital,ZhejiangUniversityofTraditionalChineseMedicine,Hangzhou310006,China2.DepartmentofOncology,theAffiliatedHospitalofHangzhouNormolUniversityHangzhou310015,ChinaCorresondingauthor:ShuQi-jin,E-mail:.Abstract：ObjectiveTostudytheinhibitoryeffectofaqueousextractofT.chinensisvaronvitroculturedhumanlungcarcinomaA549cell,andtoexploreitsmechanism.MethodsTheinhibitoryeffectofT.chinensisvaronhumanlungcarcinomaA549cellwastestedbyMTTmethod；time-effectrelationshipwasobservedbygrowthcurve；effectsonblockageofcellcycleandapoptosiswasinspectedbyflowcytometry；morphologyoftheA549cellwasobservedbyinversionmicroscopeandelectronmicroscope.ResultsTheaqueousextractofT.chinensisvarhasinhibitoryeffectontheproliferationofcellA549,andthemechanismrelatedtoblockingthecycleofcellA549atG0/G1periodandinducingapoptosisoftumorcell.ConclusionsTheaqueousextractofT.chinensisvarhasinhibitoryeffectontheproliferationofcellA549.Subjectwords：T.chinensisvar；inhibitoryeffect；humanlungcarcinomaA549cell红豆杉是红豆杉科红豆杉属植物总称，是世界上公认的濒临灭绝的天然珍稀抗癌植物。基金项目：浙江省自然基金项目（NO.Y2081051），浙江省中医药科技计划重点项目（NO.2009ZA003）通讯作者：舒琦瑾，浙江省杭州市邮电路54号浙江中医药大学附属第一临床医学院肿瘤科，邮编：310006，电话传真E-mail:本草纲目就记有红豆杉治疗霍乱、伤寒、排毒等疗效，现代中药大辞典、本草推陈等医药书中则有进一步记载。其性味苦、平，有小毒，归心经，功效消肿散结，主治：肿瘤、肾病、风湿等。目前已经从红豆杉中分离出400多种化合物，包括紫杉烷类化合物和少量的非紫杉烷类化合物1-6。水煎剂是中药应用的传统方式及临床应用的主要方式，红豆杉水煎剂已在临床广泛应用,且安全有效。目前国内外尚未见应用红豆杉水提物抑制肿瘤的研究报道。本课题通过对南方红豆杉水提物的研究，验证其对人肺癌A549细胞的增殖抑制作用，进一步阐明南方红豆杉水提物的抗肿瘤作用，为天然药物南方红豆杉的开发应用提供理论和实验依据。仪器和材料Elx808型酶标仪（美国BioTek公司），FACSCalibur流式细胞仪（美国BD公司），BX20型荧光显微镜摄像机（日本OLYMPUS公司），ULTRACUTE超薄切片机（奥地利Reichert-Jung公司），JEM-1230型透射电镜（日本JEOL公司）。南方红豆杉：购自浙江省中医院中药房，宁波泰康红豆杉生物工程有限公司生产,规格：8g/袋。人肺腺癌细胞株A549，购自中国科学院上海细胞生物学研究所。Hylcone胎牛血清（美国Thermo公司），F12-K培养液（美国GIBCO公司），MTT粉（美国Sigma公司），AnnexinV/PIapoptosiskit（美国Invitrogen公司），DNA染色剂（美国AMRESCO公司）。方法1.细胞培养用体积分数为10的胎牛血清F12-K培养液，在37、体积分数为5的CO2培养箱中培养，细胞呈贴壁生长，实验时均取对数生长期细胞。2.药物制备考文献方法7，80g南方红豆杉3次煎煮药液经真空抽滤器过滤，电磁炉上浓缩至约100ml，于旋转蒸发仪上浓缩成约40ml药液，入真空干燥箱中干燥，按100%浓度计算得率。取1g水提物，加入10ml超纯水，溶解、离心，取上清液，再经0.22m微孔滤膜除菌，制成母液浓度100mg/ml，置-20冰箱备用。3.MTT法收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度约5104/ml，接种于96孔板，每孔加入100L，培养箱中培养至细胞单层铺满孔底，以F12-K培养液稀释药物至不同浓度，每孔加入100L，水提物浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/ml，并设空白组和阳性对照组，每浓度设3个复孔。培养24小时后，倒置显微镜下观察。每孔加入20LMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h，2000r/min离心96孔板，利用虹吸原理弃去培养液。每孔加入150L二甲基亚砜，置摇床上振荡10min。在酶标仪490nm波长处测量各孔的吸光值（OD值）。按下列公式计算细胞生长抑制率：生长抑制率=（1-实验组吸光度值/对照组吸光度值）100%。用SPSS13.0统计软件分析处理，剂量和效应关系用药物浓度抑制软件（LOGIT法）版本1.0.0求半数抑制率（IC50）。4.生长曲线法收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度约2104/ml，接种于96孔板，每孔加入100L，培养箱中培养至细胞单层铺满孔底，以F12-K培养液稀释药物至0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/mL,每孔加入100L,各取4个复孔。培养24h、48h、72h、96h、120h，倒置显微镜下观察。每孔加入20LMTT溶液，继续培养4h，2000r/min离心96孔板利用虹吸原理弃去培养液。每孔加入150L二甲基亚砜，置摇床上振荡10min。在酶标仪490nm波长处测量各孔的吸光值（OD值）。根据药物浓度及各孔吸光值，绘制细胞生长曲线。5.流式细胞仪检测细胞周期及凋亡取对数生长期A549细胞用0.25%胰酶-EDTA消化，制成2105/ml细胞悬液接种于60mm无菌培养皿中，5105个/皿。培养箱内培养24h贴壁后弃上清，加入无血清F12-K培养液，饥饿同步化18h后，使细胞停滞于G0期8。空白对照组加入10%胎牛血清的F12-K培养液，药物组设置三个浓度分别为：药物A组：2mg/ml，药物B组：2.5mg/ml，药物C组：3mg/ml，另设阳性对照组（DDP组），给予DDP200g/ml.培养24h后，收集上清液细胞，0.25%胰酶-EDTA消化，1000r/m离心10min，收集贴壁细胞，1640培养液洗涤2次，1000r/m离心10min,加入70%冷乙醇在4固定12h,在检测细胞凋亡的试管中先后加入1Buffer100ml，AV染液5L，PI染液1L，避光15min，再加入1Buffer400L，上机检测；在检测细胞周期的试管中加入1mL的DNA染色剂，避光30min，上机检测.并用随机软件进行数据分析，用SPSS13.0统计软件分析处理。6.细胞凋亡形态学观察在Olympus倒置显微镜下观察培养瓶中的活细胞,并于电镜下行超微结构观察。细胞经2.5%戊二醛和1%锇酸双固定,梯度乙醇和丙酮脱水,Epon812树脂包埋,超薄切片机(ULTRACUTE型)切片,行醋酸钠和柠檬酸铅双重染色,在透射电镜下观察并拍照。结果1.MTT法药物敏感实验200g/ml浓度组DDP的抑制率为70.46%，南方红豆杉水提物作用A549细胞24h后，对A549细胞有明显的抑制作用，且随着药物浓度的增加，其抑制作用逐步增强，呈明显的剂量效应关系。IC50为2.20mg/ml。2.南方红豆杉水提物对A549细胞作用的生长曲线的影响根据5d的MTT结果来绘制生长曲线，结果示：低浓度的水提物对A549细胞的抑制呈时间、剂量依赖性。（图1）3.南方红豆杉水提物对人肺癌A549细胞周期及凋亡的影响3.1南方红豆杉水提物对人肺癌A549细胞周期分布的影响实验结果显示：与对照组相比，经药物处理24h后的细胞呈现细胞周期阻滞，表现为G1期细胞增多，S期细胞相应减少，使其发生G1期阻滞，且随着给药浓度的增加，作用增强，呈现一定的剂量效应关系（表1，图2）。3.2.南方红豆杉水提物对人肺癌A549细胞凋亡的影响实验结果显示：与空白对照组相比，经药物处理24h后的细胞早期凋亡的比例均有明显升高，且早期凋亡的比例呈现一定的剂量效应关系（表2，图3）。4.南方红豆杉水提物对人肺癌A549细胞形态的影响4.1倒置显微镜观察细胞形态变化红豆杉水提物2、2.5、3mg/ml处理A549细胞24h后，结果显示：与正常细胞相比，随着水提物剂量增加，A549细胞增殖受抑制，形态发生明显变化，细胞出现皱缩、坏死，呈典型凋亡表现（图4-图7）4.2电镜观察细胞形态变化水提物2、2.5、3mg/ml处理A549细胞24h后，与正常细胞相比，随着红豆杉水提物剂量增加，A549细胞形态发生明显变化，出现细胞核固缩，细胞核碎裂，凋亡小体形成等凋亡的典型形态学改变（图8-图11）。讨论细胞周期分为：G1期（DNA合成前期）、S期（DNA合成期）、G2期（DNA合成后期）、M期（有丝分裂期）。S期进行染色体复制和M期将复制的染色体分配到两个子细胞中是细胞周期的两个基本条件。细胞分裂的精确性及定时性是正常细胞生长和分化所必须，肿瘤的发生和发展起源于细胞周期“start”位点的失控，使大量G0期细胞无限制地通过G1/S和G2/M转换，从而导致细胞的异常增殖。肿瘤细胞的增殖动力学特点表现为细胞群体分布主要与DNA合成活跃的S期有关，细胞一旦进入此期，如无特殊干扰，便能按细胞周期的顺序发展下去，直至重新回到G1期。因此若在G1/S和G2/M期予以阻断，便能有效控制肿瘤细胞周期，从而控制肿瘤增殖。随着肿瘤分子生物学研究的深入，人们认识到肿瘤的发生和发展不仅与肿瘤细胞的增殖、分化异常有关，而且同细胞凋亡的调控失常有关。因此，设法诱导肿瘤细胞的凋亡已成为一种新的治疗方向9。本研究表明，南方红豆杉水提物具有一定的抑制人肺癌A549细胞增殖的作用，并呈一定的剂量依赖性和时间依赖性。南方红豆杉水提物能够阻止人肺癌A549细胞周期于G0/G1期，诱导其凋亡，为该中药抗肿瘤作用机制之一。鉴于几乎所有的癌基因、抑癌基因的生物学效应最终都归结到细胞周期的机制上10，因此如何调控细胞周期以及特异性地诱导肿瘤细胞凋亡已成为当前肿瘤研究的特点。至于南方红豆杉水提物阻滞肿瘤细胞细胞周期，诱导肿瘤细胞凋亡的确切作用机制，尚需进一步研究证实。参考文献1ShlQW,KiyotaK.NewnaturaltaxanedlterpenoidsfromTaxusspeciessince1999.ChemBiodiv,2005,2:15972PannerVS,JhaA,BishKS,etal.Constituentsofyewtrees,Phytochemitry,1999,50(8):12673FarinaV.Thechemistryandpharmacologyoftaxolanditsdefivatives.AmsterDam:Elsevier,1995,22:554AppendinoG.Thephytochemistryoftheyewtree.NatProdRep,1995,12:3495GeorgGI,ChenTT,OjimaI,etal.Taxaneanticanceragents,basicscienceandcurrentstatus.WashingtonDC:AmericanChemicalSociety,1995,583:16BalogluE,KingstonDGI.Thetaxanediterpenoids.JNatprod,1999,62(10):14487李秀云.中药房中药店工作手册.广州:广东科技出版社,1991:103.8王晓华,马萍,尹元琴,等.斑蝥素对A549细胞增殖抑制作用的研究沈阳药科大学学报，2006，23（9）：5986009张卫东，赵惠儒，阎影，等.斑蝥素诱导人肺癌A549细胞凋亡及其分子机制的研究中华肿瘤杂志，2005，27（6）：33033410BlagosklonnyMV，PardeeAB.Exploitingcancercellcyclingforselectiveprotectionofnormalcell.CancerRes，2001，61(11)：43014305附表1南方红豆杉水提物对A549细胞周期的影响（s，n=3）组别G1(%)S(%)G2(%)空白对