HT29细胞.doc

苦参碱对人类结肠癌细胞HT29增殖的影响和它的抗肿瘤机制摘要苦参碱是从苦参根中提取的主要活性成分，该化合物在多种癌细胞中具有很强的抗肿瘤活性。然而，苦参碱的在结肠癌细胞中的抗肿瘤活性仍不明确，这项研究的目的是为了考察苦参碱对人类结肠癌细胞生长和相关蛋白表达的影响。采用MTT法测定细胞增殖，流式细胞仪（FCM）分析细胞周期分布和凋亡。蛋白质印迹分析法检查胱门蛋白酶的活化以及抗凋亡和促凋亡因子的表达。据证明，随着时间和剂量苦参碱能显著抑制HT29细胞的增殖，也能减少 G2/M时相细胞的百分率，这很可能与增加细胞周期中G0/G1细胞时相的阻滞有关。蛋白质印迹分析法表明，苦参碱能诱导半胱天冬酶-3或半胱天冬酶-9活化并促进细胞色素C从线粒体释放到胞浆。此外，促凋亡因子Bax上调和抗凋亡因子Bcl2下调，最终将导致Bcl2/Bax蛋白的比率降低。结果表明，在体内苦参碱能抑制细胞增殖并诱导 HT29人类细胞的凋亡。通过上调 Bax下调 Bcl2可诱导细胞凋亡，细胞色素C从线粒体释放到胞浆和胱门蛋白酶-3胱门蛋白酶-9的激活后，将会引起重要的凋亡级联反应。苦参碱在HT29人类细胞中有很强的抗肿瘤活性，在治疗结肠癌中可以作为一种新的有效试剂。材料与方法试剂和药物苦参（化学结构如图1，纯度98%,用于高效液相分析），苦参碱性的分子式为C15H24N2O，分子量248.36。这项研究中，苦参溶解在细胞培养基中，储备液浓度20 mg/ml，并在-20储存。每个实验开始前，储备溶液要现稀释于培养基中。胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司，杭州，中国）。RPMI1640培养基（基凯基生物科技有限公司，中国南京），十二烷基硫酸钠（SDS），MTT，L-谷氨酰胺和膜联蛋白异硫氰酸荧光素/碘化丙锭(Annexin VFITC/PI) 凋亡检测试剂盒（北京Biosea生物技术有限公司，北京，中国）。特异性抗体Bcl-2，Bax，细胞色素C和和-肌动蛋白（RD系统公司，明尼苏达州明尼阿波利斯，美国），抗半胱天冬酶-3和半胱天冬酶-9（武汉博士德生物工程有限公司，武汉，中国），JC-1探测器（Beyotime生物技术研究所，南通，中国）细胞系和细胞培养人类结肠癌HT29细胞系（武汉大学中南医院，肿瘤部门，中国武汉）。将该细胞培养在RPMI-1640培养基中，培养基中有10热灭活的胎牛血清（FCS），1L-谷氨酰胺和1青霉素 - 链霉素，置于含有5%二氧化碳的潮湿环境中。用25cm的组织培养瓶单层培养HT29细胞，并定期用1胰蛋白酶 - 乙二胺四乙酸（胰蛋白酶-EDTA）溶液将细胞与培养瓶表面分离。用CC108微型血球计数器（希森美康，日本神户）确定细胞数量。对数生长期的细胞用于以下阐述的所有研究。MTT实验MTT实验检测线粒体脱氢酶还原形成的蓝色甲臜产物，它反映了细胞线粒体的正常功能和细胞的存活率。当用苦参碱孵育在96孔板上的细胞24, 36或48 h后，用磷酸缓冲液洗涤细胞（104/孔）两次，然后将MTT溶液(100 g/0.1 ml PBS缓冲液 )加到每个空中。细胞在37的条件下孵育4h。加入100l二甲基亚砜(DMSO)溶解甲臜结晶，用分光光度计在570nm处测量吸光度。细胞增殖抑制率计算方法：1-（给药组孔中的平均OD值/对照组孔中的平均OD值）*100。如之前所阐述的，HT29细胞的增殖反应用MTT法测定，这次及所有后续实验都要重复3次。细胞周期分析为了分析细胞周期，收集对数生长期的细胞，调整细胞浓度1x106个/ml，用不同浓度的苦参碱(4, 8 或 16 mg/ml)处理细胞。处理24h后，收集漂浮和附着细胞，离心，用冷的磷酸缓冲液洗涤，并固定在70%的冷乙醇中于4过夜。加入含有50 g/m PI，3.4 mmol/l枸橼酸钠， 20 g/ml的RNA酶A和1%的Triton X100的荧光染料溶液，混合物在室温黑暗的条件下培养30min.用流式细胞仪（德国明斯特）测量细胞周期分布，并用使用Cell Quest软件（Beckton Dickinson公司，富兰克林湖，新泽西州，美国）进行流式细胞法分析。通过Annexin VFITC/PI双染色法用流式细胞仪评估细胞凋亡用AnnexinVFITC/PI双染色法检测细胞凋亡。将HT29细胞均匀的分布在培养瓶中，并用0, 4, 8和 16 mg/ml浓度的苦参碱处理细胞24h,收集细胞，用PBS缓冲液洗涤两次并重新悬浮在1x106个细胞/ml的膜联蛋白-V结合缓冲液中。用5 l膜联蛋白-V-FITC和5lPI在室温避光的条件下孵育上清液（100微升/管）15min,然后向每管加入400 l结合缓冲液，染色1h后用流式细胞仪分析，所有实验重复进行三次。细胞色素C从线粒体向细胞质释放的检测用蛋白质印迹分析法检测细胞色素C在细胞质和线粒体的分布，分别处理细胞并用冰冷的PBS缓冲液洗涤后，收集细胞。为了分离线粒体和细胞质，将细胞在缓冲液中超声，缓冲液含有10摩尔PH7.5的盐酸缓冲液，10mol氯化钠，175mol蔗糖和12.5摩尔EDTA,以1,000 x g离心细胞提取物10min成核，将得到的上清液在18,000 x g下离心30min沉淀线粒体并纯化。得到的上清液为细胞质。将沉淀溶解，用Bradford蛋白质测定法评价两个组分的蛋白含量，等量的蛋白被15%钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）分离并电转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，然后将该膜温育在含有5%脱脂乳的洗膜缓冲液（TBST）中2h，接着分别用一级抗体过夜培养，用TBST充分洗涤培养后的薄膜后，再用二级抗体培养薄膜2h，随后用TBST充分洗涤后，用电化发光(ECL)检测试剂盒检测免疫复合物。蛋白质印迹分析用蛋白质印迹分析法分析苦参碱对蛋白表达的影响。用苦参碱处理后，用Tekmar声波干扰器（功率设定60）连续三次超声10S，悬浮和贴壁的细胞溶解在缓冲液A中（10mol盐酸缓冲液，1molEDTA，10%甘油，1mg / ml的亮肽素，2 g/ml抑肽酶和3.28 mg/ml的苯甲基磺酰氟）。用SDSPAGE（5积层凝胶，10分离胶）分离蛋白，并用半干印迹装置将蛋白转移到硝酸纤维素。薄膜在室温下用5%的脱脂奶粉培养过夜，然后用TBST洗涤三次，每次5min。保持室温，然后用与Bcl-2，Bax胱天蛋白酶3或-9或肌动蛋白结合的抗体滴定1h,随后如之前所述洗涤薄膜，并在室温下用辣根过氧化物酶偶联的山羊抗鼠免疫球蛋白G或山羊抗免疫球蛋白G 培养1h.用TBST将膜洗涤三次，在用ECL试剂盒检测。用光密度计定量免疫反应带强度。统计分析结果用SD值表示，用方差分析（ANOVA）和t检验法评价统计学显著性，P0.05表示存在统计学显著性差异。结果苦参碱对HT29细胞生长的抑制作用苦参碱对HT29细胞的抗增殖作用用MTT法检测，结果表明在体外随着浓度增加，苦参碱浓度为232 mg/ml分别处理24,36,48h,HT29细胞依赖时间和剂量它的增殖作用被显著抑制。(P0.05; 表 I 和图2).苦参碱诱导G0/G1 细胞周期阻滞为了检测苦参碱对细胞周期的影响，细胞不用苦参碱处理或用制定浓度的苦参碱(4, 8 or 16 mg/ml)处理，用流式细胞仪细胞分析细胞周期分布。如图3，苦参碱依赖剂量显著增加G0/G1期染色细胞数量，并减少G2/M期细胞染色数量，说明苦参碱在G0/G1期抑制HT29细胞生长，这导致S期和 G2/M 期的细胞数量大大减少。细胞凋亡检测在细胞凋亡早期，细胞膜产生微扰，并导致磷脂酰丝氨酸在细胞外的再分配，膜联蛋白V选择性的与磷脂酰丝氨酸结合从而使用荧光素标记的膜联蛋白V试剂盒确定发生凋亡的细胞。用膜联蛋白V-FITC/ PI双染法检测HT29细胞的凋亡。同时用碘化丙啶将细胞染色以区分早期凋亡细胞和坏死细胞。利用流式细胞仪收集10000个事件，细胞的成活率，死亡率和凋亡率按照方法中所述测定，结果显示在图4.存活的细胞位于左下角（膜联蛋白V-FITC和PI阴性），早期凋亡细胞位于右下角（膜联蛋白V-FITC阳性），凋亡晚期的细胞细胞膜和细胞核逐渐破损，位于右上角（双阳性）。细胞色素C从线粒体到细胞质的释放为了对某些凋亡刺激物有所响应，细胞色素C从线粒体释放到细胞质，在细胞质中细胞色素C与凋亡蛋白酶激活因子（Apaf 1）结合以促进凋亡小体的合成和半胱天冬酶-9的激活。在细胞凋亡的级联反应中，细胞色素C从线粒体释放是一个关键的步骤，这是因为它能够激活下游的半胱氨酸蛋白酶。因此，苦参碱处理HT29细胞后，用蛋白印记分析法考察细胞色素C在线粒体和细胞质的分布。如图5所示，可以观察到，随着苦参碱浓度的增加，细胞色素C在细胞质的含量增加同时在线粒体的含量减少。Bax 和Bcl2 蛋白的表达为了掌握苦参碱在人类结肠癌细胞HT29中抗细胞增殖的机制，需要考察凋亡相关蛋白的表达（图5）。蛋白印记分析法证实，苦参碱浓度在416 mg/ml范围内，随着剂量下调Bcl-2蛋白并上调Bax蛋白，最后导致Bcl2/Bax 蛋白比率减小。研究表明，Bcl2蛋白和主要的抑制剂 Bax蛋白是细胞增殖和细胞凋亡的关键调节剂。Bcl2蛋白表达过度会通过抑制细胞凋亡而增加细胞存活率，而Bax蛋白过度表达会加速细胞凋亡。苦参碱引起诱导细胞凋亡，阻滞细胞周期，降低Bcl2/Bax的蛋白比率，这可能是苦参碱抗癌细胞增殖的一个重要机制。半胱天冬酶-3和半胱天冬酶-9的活化对裂解和长链的半胱天冬酶-9的蛋白印记分析得出，用不同浓度4, 8 16 mg/ml的苦参碱处理细胞24h后，苦参碱会逐渐诱导半胱天冬酶-9增加（图6），苦参碱剂量为16 mg/ml时裂解的半胱天冬酶-9碎片的数量达到平稳，碎片出现并伴随着长链酶的减少，而在对照提取物组中未检测到碎片。半胱天冬酶-3直接激活半胱天冬酶-9，同样要对它检测。用苦参碱处理后，在第24h检测到17 kDa裂解的半胱天冬酶-3，并观察到裂解碎片数量增加。讨论癌症的化学预防被定义为使用无毒的化学物质抑制，延缓或逆转致癌的过程，它被视为控制癌症发展的一个很有前景的方法。据报道多种化合物可以防止化学致癌，并作为癌症的化学预防药物。在这些化合物中，苦参碱是一个有前景的植物化学药物，它在癌症多阶段具有化学预防活性，苦参碱是一种天然的多酚类植物抗毒素，动物体内实验证明它具有癌症化学预防活性。1958年苦参碱首次从苦参中分离并确定，在中国作为一种抗癌的治疗药物而被广泛使用。苦参碱低毒副反应小，可以用于儿童和婴儿。然而，据我们所知，苦参碱对胰腺癌的作用之前并未报道。细胞增殖的不可控性是癌细胞一个重要的生物特征，通过抑制细胞增殖可以抑制肿瘤的生长。本次研究就是要考察是否苦参碱可以减小肿瘤细胞的增殖速率。MTT实验表明，当用416 mg/ml苦参碱处理细胞时，它对HT29细胞的生长抑制作用随着时间剂量增加而增强。FCM表明，苦参碱能显著抑制HT29细胞的G0/G1期（图3），这说明苦参碱的抗增殖作用的机制是延迟细胞周期进程。细胞凋亡不仅存在于正常的细胞中，也与多种疾病的产生有关。细胞凋亡与细胞增殖失调是产生肿瘤的重要原因，抑制细胞增殖诱导细胞凋亡是联合治疗癌症的重要手段。为了确定苦参碱的抗癌机制，在本次研究中要评估该化合物的促凋亡性质。Annexin VFITC/PI双染色法表明，苦参碱在416 mg/ml范围内能够依赖剂量诱导细胞凋亡。目前的研究结果表明，减少细胞增殖和诱导细胞凋亡的共同作用是苦参碱抗癌治疗的两个重要手段。由于这些化合物诱导细胞凋亡的机制并不明确，本次研究中要检测几个凋亡相关蛋白在HT29细胞中的表达和定位的变化。Bcl-2家族蛋白包括Bcl2 和 Bax，由促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白组成，用于控制细胞增殖，分化和细胞程序性死亡。细胞凋亡的关键调节步骤是通过抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白的比例控制的，Bax是Bcl2家族蛋白的促凋亡因子，在正常条件下以单体的形式存在细胞质中或松散的附着在细胞膜上。凋亡刺激物刺激后，细胞质中的Bax和单体Bax转移到线粒体中，在线粒体中Bax能形成完整的膜蛋白，并形成交联的同源二聚体，它可以使一些因子如细胞色素C从线粒体释放，产生细胞凋亡。Bcl2和它的相关蛋白控制细胞色素C从线粒体的释放。细胞凋亡过程的特点包括半胱氨酸蛋白酶的激活，它是细胞凋亡的引发剂。在细胞质中，细胞色素C激活半胱天冬酶-9，从而激活效应效应凋亡蛋白酶包括半胱天冬酶-3。这项研究中，苦参碱减小抗凋亡/促凋亡蛋白B