毕业论文-复方中药枳术汤对雏鸡生产性能及免疫器官的影响.doc

河北农业大学本科毕业论文题 目：复方中药枳术汤对雏鸡生产性能及免疫器官指数的影响 学 院： 动物医学院 专业班级： 动物医学1002班 学 号： 2010084020208 学生姓名： 曹莹莹 指导教师姓名： 赵兴华 指导教师职称： 副教授 2014年06月04 日 复方中药枳术汤对雏鸡生产性能及免疫器官的影响动物医学1002班：曹莹莹指导教师：赵兴华摘要：实验旨在研究复方中药枳术汤对雏鸡生产性能和免疫器官的影响。选择175只一日龄海蓝灰雏鸡随机分为5组：采用标准日粮进行饲喂。经母源抗体检测后，、四组于10日龄首免鸡新城疫C30-86冻干苗，在10日龄时按照日饲料量的1%(组)、2%（组）饲喂复方中药枳术汤（ZZT），28日龄二次免疫（剂量和方法同首次免疫）。组为空白对照组，不免疫不给药，正常饲养。于17、24、31、38、45日龄时，早晨8点喂料之前进行称重，然后每组分别随机抽取7只鸡，心脏采血，离心分离血清待用，采集免疫器官并计算免疫器官指数。通过测定试验雏鸡的日增重、料肉比、免疫器官指数、IL-2血清ND抗体水平、 IFN-的影响。结果显示，枳术汤对雏鸡ND抗体水平影响：从17日龄到38日龄，枳术汤组与阴性对照组之间的ND抗体水平整体存在着明显差异（p0.05）。枳术汤组对雏鸡INF-r以及IL-2水平的影响：从17日龄45日龄，枳术汤组与阴性对照组之间的INF-r及IL-2的水平存在着显著的差异（p0.05）。枳术汤组对雏鸡免疫器官指数的影响：从17日龄到45日龄，枳术汤组与阴性对照组之间脾指数不存在明显的差异；从31日龄到哪45日龄，枳术汤组与阴性对照组间存在着明显差异。枳术汤组对雏鸡肠道IgA抗体水平的影响：从4月21日到5月19日，对于雏鸡十二指肠、回肠、P结IgA水平，枳术汤组与阴性对照组之间存在着明显的差异（p0.05）。关键词：复方中药枳术汤；免疫器官指数；IL-2；法氏囊；脾脏；雏鸡；生产性能Effect of compound Chinese herbal medicine of Zhizhu Decoction on production performance and immune organs in chickens Student： Yingying Cao Advisor： Xinghua Zhao(College of Animal Science and Technology, Agricultural University of Hebei ,Baoding 071001)Abstract：The experiment was conducted to study the effects of compound Chinese medicine of Zhizhu Decoction on production performance and immune organs in chickens. 175 day old blue gray chickens were randomly divided into 5 groups:the standard diet fed. The detection of maternal antibodies, , , , , four groups at 10 days of age the first immunization of Newcastle disease virus C30-86 vaccine, intranasal instillation of 2 per chicken feather, at the age of 10 daysin accordance with the amount of feed of 1% (group I), 2% (Group II) fed withcompound Chinese medicine Zhizhu soup (ZZT), 28 days (two times of immunization dose and method with the first immune). V group was the blank control group, is not immune to the medicine, the normal feeding. In 17, 24, 31,38, 45 days, 8 points before morning feeding were weighed, and each groupwere randomly selected from 7 chickens, heart blood, standing for two hours,centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes to separate serum stand-by, collect and calculate the immune organ index of immune organs. Through the test of thedaily weight gain, feed and meat chickens than, immune organ index, serum NDantibody levels of IL-2, IFN- . The results showed that, with the overall advantages of Zhizhu Decoction on production performance and immune organ index of chicks.Key words: Compound Chinese medicine of Zhizhu Decoction; immune organ index; IL-2; chicken; production performance1.前言抗生素作为饲料添加剂在饲料工业中的应用已有几十年的历史，曾对畜牧业的发展起到了积极的推动作用1。随着社会发展与经济进步，畜产品的安全问题引起人们越来越广泛的关注，而要保证畜产品的卫生安全，必须从畜牧生产的源头抓起,在生产环节严格控制直至杜绝抗生素、化学促生长物等作为饲料添加剂的使用，这已成为国内外畜牧业界的共识和研究的热点。中国传统的中草药在寻找抗生素与化学促生长物的研究中占据了重要的位置，中草药作为动物保健剂和饲料添加剂在畜牧生产中得到越来越普遍的应用并受到养殖者们的欢迎。但是，以中草药作为饲料中基本成分持续使用的研究报道还不多见。中草药是我国特有的中医药理论与实践的产物，而作为饲料添加剂使用，具有不易产生耐药性、无残留、毒副作用小、功能全面等优点，引起了畜牧业工作者的极大关注。因此，中草药饲料添加剂的研制开发，对于发展绿色畜牧业、保证人类的身体健康、促进畜产品的出口创汇，具有重要的经济效益和社会效益。枳实为芸香科植物酸橙及其栽培变种或甜橙的干燥幼果，枳实属理气中药，有破气消积；化痰除痞的功效。白术是菊科苍术属的一种植物，单叶、狭长，花紫色，头状花序，以根茎入药，能够补脾益气、燥湿利水。其含有白术多糖 、挥发油 、氨基酸等多种有效成分3-6。白术多糖在一定的浓度范围内能单独激活或协同ConA、PHA促进正常小鼠淋巴细胞转化，并明显提高IL-2分泌的水平。氢化可的松造成小鼠的免疫抑制，白术多糖对淋巴细胞的增殖功能有恢复的作用，并提高免疫抑制小鼠脾脏细胞体外培养的存活率，延长淋巴细胞寿命，纠正T细胞亚群分布紊乱状态，可使低下的IL-2水平显著提高8。本试验采用标准日粮进行饲喂。经母源抗体检测后，、四组于10日龄首免鸡新城疫C30-86冻干苗，在10日龄时饲喂复方中药枳术汤（ZZT），28日龄二次免疫（剂量和方法同首次免疫）。组为空白对照组，不免疫不给药，正常饲养。于17、24、31、38、45日龄时，早晨喂料之前进行称重，然后每组分别随机抽取7只鸡，心脏采血，离心，分离血清待用，采集免疫器官并计算免疫器官指数。2 材料与方法2.1 试验材料2.1.1 试验动物与试剂药品1日龄健康海兰灰雏公鸡，购自北京市峪口种鸡场；鸡新城疫C30-86疫苗（杭州荐量生物工程有限公司，批号：121005）；免疫因子 (河南森隆兽药有限公司，批号：20120821)；鸡新城疫抗原（中国兽医药品监察所，批号：120313）；一次性血凝板APES（姜堰市新康医疗器械有限公司）；IFN-、IL-2试剂盒（均购自美国RD公司）；磷酸缓冲盐、枸橼酸钠、枸橼酸、乙醇、PBS磷酸缓冲盐等均为国产分析纯试剂；中草药枳实和白术购于河北省安国市中草药批发市场。2.1.2 主要仪器设备MDF-382E直立式超低温冰箱（SANYO Electric Biomedical）；BCD-189型冰箱（青岛海尔股份有限公司）；移液器（百得实验仪器有限公司）；XSP-C型生物显微镜（重庆广电仪器有限公司）；酶标仪9602（北京普朗有限公司）；AS200-5型电子天平（OHAUS）；LDZ4-0.8型低速离心机（北京医用离心机厂）；HPX-9162MBE数显电热培养箱（上海博讯实业有限公司）；DHW-600恒温水浴锅（北京国华仪器厂）；KQ-400DB型KQ-400DB（昆山超声仪器有限公司）；MILLI-QRG纯水处理器；YX-280D高压灭菌锅（江阴滨江医疗设备厂）2.2 试验方法2.2.1 试验动物饲养与分组处理试验前1周，将饲养工具与周围环境用高锰酸钾与甲醛进行熏蒸1d，然后开窗通风。在雏鸡到之前将室内温度提高到36，饲养连续三天后，将室内温度逐渐下降至室温；前3天光照24h，以后每天降一小时逐渐到日常光照；前十天室内湿度为70%左右，饲喂十天后逐渐降至60%；保证充足洁净饮水，采用标准日粮进行饲喂。将175只1日龄海蓝灰雏鸡随机分为5组，每组35只，7个重复，采用标准日粮进行饲喂。经母源抗体检测后，、四组于10日龄首免鸡新城疫C30-86冻干苗，每只鸡滴鼻点眼2羽份，在10日龄时按照日饲料量的1%(组)、2%（组）饲喂复方中药枳术汤（ZZT），28日龄二次免疫（剂量和方法同首次免疫）。组为空白对照组，不免疫不给药，正常饲养。于17、24、31、38、45日龄时，早晨8点喂料之前进行称重，然后每组分别随机抽取7只鸡，心脏采血，静置两小时后，3000 转/分钟离心10分钟分离血清待用，采集免疫器官并计算免疫器官指数。具体分组及用药见表1。表1试验分组与用药Table 1 Animal treatment in different groups组别n给药浓度给药方式给药时间免疫情况 I 枳术汤组351%拌料Day 10-45C30-86冻干苗II“免疫因子”组35按说明投药拌料Day 10-45C30-86冻干苗 III 空白对照组352.2.2 生长性能测定在每个试验时间点早晨8点喂料之前进行称重，记录每天耗料量。计算平均日增重和料肉比。平均日增重（末重初重）/天数； 料肉比日耗料量/日增重；2.2.3 免疫器官指数的测定将各组雏鸡早晨8点开始空腹称重；采集对应的脾脏、法氏囊和胸腺，用滤纸吸去表面水分，然后用分析天平称重、记录。根据所称重量计算免疫器官指数。免疫器官指数=免疫器官重mg/体重g2.2.4 血清ND抗体水平检测 4单位抗原的配制在一次性96孔微量血凝板上标号，第一排1-11孔依次向每孔加入PBS液25L，第12孔加50L，二三排重复上述操作。再向每排的第1孔加入25L按标签稀释后的鸡新城疫抗原，吹吸混合均匀，吸25L至第2孔，吹吸混合均匀，依次同上向后倍比稀释至第11孔，弃去25L。然后每排的第1-11孔加入PBS液25L，最后每孔加入1%的鸡红细胞悬液25L，第1-11孔为试验组，第12孔为红细胞对照孔。将96孔板置于微量振荡器上震动混匀，室温静置40分钟，观察结果。结果判定，96孔板倾斜45，和对照孔进行比较。倾斜后底部红细胞完全不流动为被新城疫抗原完全凝集，底部红血球呈线性流淌表明红细胞未被或不完全凝集。以100%凝集的抗原最大稀释倍数为该抗原血凝价，即一个凝集单位，从该孔的抗原稀释倍数除以4的稀释倍数，则作为该抗原的4单位抗原。检测血清抗体时对抗原进行二标用以检测抗原配比比例正确。 样品的检测在一次性96孔微量血凝板上，每排1-11孔依次向每孔加入PBS液25L，第12孔加50L，再向每排的第1孔加入25L待测血清，吹吸混合均匀，依次同上向后倍比稀释至第10孔，然后向第1-11孔每孔加入25L 4单位抗原，在微量振荡器上振荡混匀，室温静置30分钟，向每孔加入1%的鸡红细胞悬液25L，振荡混匀，室温静置40分钟，观察。11孔为抗原对照孔，12孔为红细胞对照孔，结果以出现完全凝集的抗原最大稀释度为该抗原的血凝滴度孔。2.2.5 IFN-含量的测定将冷藏室的鸡干扰素（IFN-）ELISA检测试剂盒取出，置于室温（25）平衡20分钟。然后将平衡后的酶标板，按照说明要求依次向标准品孔加入不同浓度的标准品50L。样本孔加待测血清样本10L后，加入样本稀释液40L，空白孔不加液体。然后将标准品孔和样本孔中每孔加入检测抗体（酶标记）100L，封膜后置于恒温箱温育60分钟。用洗涤液洗涤5次，拍干后每孔加入底物溶液A、底物溶液B各50L，37避光温育15分钟，然后每孔加入终止液50L。在酶标仪450nm波长处检测OD值。根据标准品制作标准曲线，依据样品的OD值，在标准曲线上查找对应的浓度。2.2.6 IL-2含量的测定将冷藏室的鸡白介素（IL-2）ELISA检测试剂盒取出，置于室温（25）平衡20分钟。然后将平衡后的酶标板，按照说明要求依次向标准品孔加入不同浓度的标准品50L。样本孔加待测血清样本10L后，加入样本稀释液40L，空白孔不加液体。然后将标准品孔和样本孔中每孔加入检测抗体（酶标记）100L，封膜后置于恒温箱温育60分钟。用洗涤液洗涤5次，拍干后每孔加入底物溶液A、底物溶液B各50L，37避光温育15分钟，然后每孔加入终止液50L。在酶标仪450nm波长处检测OD值。根据标准品制作标准曲线，依据样品的OD值，在标准曲线上查找对应的浓度。2.3统计学处理通过SPSS 17.0 软件进行处理，使用统计学进行单变量方差 (one-way ANOVA) 分析，数据以平均数标准差(XS)表示，差异极显著设为P0.01，显著性水平设为 P0.05。3. 结果与分析表1 枳术汤对雏鸡新城疫抗体的影响Table 1 Effect of Zhizhu decoction on Newcastle disease antibodies 17d24d31d38d45d枳术汤组60.82b5.860.69a5.861.07a5.291.38a4.710.95a阴性对照组50.82c4.140.69b3.570.53b3.860.38b3.571.40a阳性对照组70.82a4.570.53b3.430.53b3.290.76b3.860.38a注：同列数据肩注小写字母完全不同表示差异显著，含相同字母表示差异不显著。从表1可以看出：对雏公鸡ND抗体水平方面，17日龄时，对雏鸡ND抗体水平方面，枳术汤组、阴性对照组和阳性对照组之间均存在显著差异（p0.05），且阳性对照组抗体水平明显高于阴性对照组和枳术汤组，；24日龄、31日龄和38日龄时，阴性对照组与阳性对照组之间无显著差异(p0.05)，枳术汤组对新城疫抗体水平的影响明显高于阴性对照组、阳性对照组，存在着明显的差异（p0.05）；45日龄时，枳术汤组、阴性对照组和阳性对照组之间均无明显差异(p0.05)，但枳术汤组的雏鸡新城疫抗体水平最高。表2 枳术汤对雏鸡INF-r的影响Table 2 Effect of Zhizhu decoction on INF-r of chicks17d24d31d38d45d枳术汤组7.831.40a6.771.11a6.820.74a7.282.11a8.401.76a阴性对照组5.182.06b4.211.75b6.000.35b3.750.78b5.561.43b阳性对照组8.632.69a5.321.00ab5.940.88b3.201.50b6.411.50b注：同列数据肩注小写字母完全不同表示差异显著，含相同字母表示差异不显著。从表2可以看出：对雏鸡的INF-r方面，在17日龄时，枳术汤组与阳性对照组、阳性对照组与阴性对照组之间均存在着显著的差异（p0.05），且阳性对照组中INF-r的含量明显高于阴性对照组和枳术汤组中INF-r的含量。枳术汤组与阳性对照组之间无显著差异(p0.05)；24日龄时，枳术汤组、阴性对照组及阳性对照组间存在着显著的差异（p0.05），且枳术汤组中INF-r的含量最高；在31日龄、38日龄、45日龄时，阴性对照组与阳性对照组之间无显著的差异(p0.05)，而枳术汤组与阴性对照组、枳术汤组与阳性对照组之间的差异明显（p0.05），且从24日龄到45日龄，枳术汤组随着日龄的增加对雏公鸡INF-r的影响而逐步增加，并且INF-r的含量最高。表3 枳术汤对雏鸡IL-2的影响Table 3 Effect of Zhizhu decoction on IL-2 of chicks17d24d31d38d45d枳术汤组10.304.46a9.794.43a30.4713.16a27.606.96a35.0816.28a阴性对照组3.031.69b1.863.27b15.608.46b18.494.74b19.194.38b阳性对照组5.453.54b4.742.83b20.484.22ab21.595.98ab15.675.67b注：同列数据肩注小写字母完全不同表示差异显著，含相同字母表示差异不显著。从表3可以看出：对雏公鸡IL-2的方面，在17日龄、24日龄时，阴性对照组和阳性对照组之间无显著的差异(p0.05)，阴性对照组与枳术汤组、阳性对照组与枳术汤组之间存在着显著的差异（p0.05），且枳术汤组中IL-2的含量明显高于阴性对照组与阳性对照组；31日龄、38日龄时，枳术汤组、阴性对照组、阳性对照组三者之间均存在着明显的差异（p0.05），其中枳术汤组中IL-2的含量最高，阳性对照组中IL-2的含量高于阴性对照组的含量；45日龄时，阴性对照组与阳性对照组之间无明显差异(p0.05)，而阴性对照组与枳术汤组、阳性对照组与枳术汤组间均存在着明显的差异（p0.05），并且枳术汤组中雏公鸡IL-2的含量高于阴性对照组和阳性对照组。说明枳术汤明显影响IL-2分泌的水平。表4 枳术汤对雏鸡胸腺指数的影响Table 4Effect of Zhizhu decoction on thymus index17d24d31d38d45d枳术汤组4.360.83a5.220.86a5.560.33a5.450.58a6.010.47a阴性对照组5.260.70a4.970.71a4.470.60b5.090.34b5.480.48b阳性对照组4.941.03a4.800.72a4.940.76b4.810.35b4.940.69b注：同列数据肩注小写字母完全不同表示差异显著，含相同字母表示差异不显著。从表4可以看出，对雏鸡的胸腺指数方面,在17日龄，枳术汤组、阴性对照组和阳性对照组三者间均无显著差异(p0.05),但阴性对照组的胸腺指数高于枳术汤组和阳性对照组,枳术汤组的胸腺指数水平最低；24日龄时,枳术汤组、阴性对照组和阳性对照组三者间均无显著差异(p0.05),其中阳性对照组中雏鸡的胸腺指数最低,枳术汤组雏鸡的胸腺指数最高；31日龄、38日龄、45日龄时，阴性对照组与阳性对照组之间无明显差异(p0.05)，而阴性对照组与枳术汤组，阳性对照组与枳术汤组均存在着明显差异(p0.05),但枳术汤组中雏鸡法氏囊的指数最高；31日龄时，枳术汤组、阴性对照组、阳性对照组之间均存在着显著差异（p0.05）,其中枳术汤组的雏公鸡法氏囊指数最高；38日龄时，阴性对照组与阳性对照组之间无明显差异(p0.05)，枳术汤组与阴性对照组、枳术汤组与阳性对照组间存在着显著的差异（p0.05）；45日龄时，枳术汤组、阴性对照组与阳性对照组三者间均存在着显著的差异（p0.05），且枳术汤组鸡的法氏囊指数高于阴性对照组和阳性对照组。17日龄到38日龄期间，枳术汤对雏鸡法氏囊的影响随着日龄的增加而逐渐增加。45日龄后有轻微的下降。表6 枳术汤对雏鸡脾指数的影响Table 6 Effect of Zhizhu decoction on spleen index17d24d31d38d45d枳术汤组1.530.20a1.990.19a2.620.35a2.400.29a2.380.18a阴性对照组1.610.28a2.220.38a2.120.36a2.190.31a1.990.57a阳性对照组1.460.33a1.900.18a2.330.34a2.000.45a2.170.41a注：同列数据肩注小写字母完全不同表示差异显著，含相同字母表示差异不显著。从表6可以看出：17日龄、24日龄、31日龄、38日龄、45日龄时，枳术汤组、阴性对照组、阳性对照组三者间均无显著的差异(p0.05),但在17日龄和24日龄时,阴性对照组的雏鸡脾指数最高,阳性对照组的雏鸡脾指数最低；在31日龄、38日龄、45日龄时，枳术汤组中雏鸡的脾指数高于阴性对照组与阳性对照组。说明枳术汤对雏鸡的脾指数无显著影响。表7 枳术汤对雏鸡肠道IgA的影响Table 7 zhizhu impact on young cock soup of intestinal IgA十二指肠回肠P结4.21枳术汤组51.174.65a33.782.05a32.151.85a阴性对照组20.481.18c18.891.74b21.161.96c阳性对照组46.371.83b33.181.43a30.602.97a5.5枳术汤组62.742.12a38.581.40a38.243.07a阴性对照组23.401.72c21.522.11c20.691.58c阳性对照组41.372.13b29.081.28b24.002.65b5.19枳术汤组64.902.46a42.642.21a46.132.92a阴性对照组23.531.64c22.111.95c22.102.27c阳性对照组35.632.90b25.831.65b28.027.76b注：同列数据肩注小写字母完全不同表示差异显著，含相同字母表示差异不显著。从表7可以看出：4月21日，试验对雏鸡十二指肠IgA的影响：枳术汤组、阴性对照组、阳性对照组三者之间均存在着明显差异（p0.05），且阳性对照组中雏鸡十二指肠IgA的含量最高；试验对雏鸡回肠IgA的影响：枳术汤组与阳性对照组间无显著的差异(p0.05)，而阴性对照组与枳术汤组、阳性对照组与枳术汤组之间存在着显著的差异（p0.05）,其中枳术汤组中雏鸡回肠IgA的含量最高,阳性对照组中雏鸡的回肠IgA的含量有明显高于阴性对照组；试验对雏鸡淋巴结IgA的影响：枳术汤组和阳性对照组间不存在显著的差异(p0.05)，而阴性对照组与阳性对照组、阴性对照组与枳术汤组间均存在着明显的差异（p0.05）,其中枳术汤组中雏鸡的淋巴结IgA含量最高,阴性对照组中的最低。5月5日，试验对雏鸡十二指肠IgA的影响：枳术汤组、阴性对照组、阳性对照组三者之间均存在明显差异（p0.05）,且枳术汤组中雏鸡的十二指肠IgA的含量明显高于阴性对照组与阳性对照组；试验对雏鸡回肠IgA的影响：枳术汤组、阴性对照组、阳性对照组三者之间均存在明显差异（p0.05）,且枳术汤组中雏鸡回肠IgA的含量明显的高于阴性对照组和阳性对照组；试验对雏鸡淋巴结IgA的影响：枳术汤组、阴性对照组、阳性对照组三者之间均存在明显差异（p0.05），其中枳术汤组中雏鸡回肠的IgA含量最高，阴性对照组的最低。5月19日，试验对雏鸡十二指肠IgA的影响：枳术汤组、阴性对照组、阳性对照组三者之间均存在明显差异（p0.05），且枳术汤组中雏鸡十二指肠IgA含量明显高于阴性对照组与阳性对照组；试验对雏鸡回场IgA的影响：枳术汤组、阴性对照组、阳性对照组三者之间均有明显差异（p0.05），其中枳术汤组中雏鸡回肠IgA含量最高；试验对雏鸡淋巴结IgA的影响：枳术汤组、阴性对照组、阳性对照组三者之间均存在明显差异（p0.05），其中枳术汤组中雏公鸡淋巴结IgA的含量最高。试验中枳术汤对雏鸡十二指肠IgA、回肠IgA以及P结IgA的影响相对于阴性对照组与阳性对照组影响最大，并且随着日龄的增加枳术汤对十二指肠IgA、回肠IgA以及P结IgA的含量也不断增加。说明枳术汤可以提高雏鸡肠道IgA的分泌水平。4讨论该中药方剂由枳实和白术组成，具有免疫增强的作用。文贵辉等认为白术多糖可以启动樱桃谷鸭免疫系统，能提高血清IL-2的浓度，从而在一定程度上提高机体的细胞免疫水平。白术多糖对1-14日龄阶段的樱桃雏鸭脾脏、胸腺和法氏囊等免疫器官的发育有一定的促进作用9。 根据报道，法氏囊、脾脏、胸腺的重量可以用来评价雏鸡的免疫状况6。法氏囊是禽类重要的中枢免疫器官，是诱导干细胞成为免疫活性细胞，并将其输送给外周免疫器官的场所。来自于骨髓的多能干细胞，经血液进入法氏囊分化成B细胞，经淋巴和血液循环移至外周免疫器官的的非胸腺依赖区并继续进行繁殖，参与体液免疫，研究证明，如雏鸡法氏囊萎缩则雏鸡不能产生抗体，如果法氏囊发育良好，则有利于抗体水平的提高。脾脏是体内最大的免疫器官，是产生抗体的主要基地11-13。本实验中，枳术汤组中的雏鸡的法氏囊指数和脾脏指数均高于阴性对照组和阳性对照组，表明其中枢和外周免疫器官发育正常，参与免疫应答的作用强。在ND疫苗二免28天后抗体水平比对照组稿，表