ACL-TOP全自动血凝分析仪实验性能评价.doc

ACL TOP全自动血凝分析系统的建立与性能评价华中科技大学同济医学院附属同济医院检验科唐宁 曹文静* 夏汛生 张碧玉 田磊*：通讯作者，华中科技大学同济医学院附属同济医院检验科，湖北 武汉 430030 电话103 EMAIL：tj_摘要：目的 对ACL TOP全自动血凝分析仪进行全面性能评价，建立优化适用的血凝分析系统。方法 按照临床和实验室标准协会(CLSI，原名NCCLS)相关文件的要求，选择代表三种方法学的指标常规进行重复性、稳定性、线性、抗生物性干扰物质实验；并与同系列ACL Futura型全自动血凝分析仪进行比对实验；收集250份健康体检者枸橼酸钠抗凝血建立ACL TOP全自动血凝分析系统本地区的生物参考区间。结果 凝血酶原时间（PT）、活化的部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶时间（TT）、纤维蛋白原（Fbg, Clauss法）、D-二聚体（D-D）、抗凝血酶（AT）的批内及日间变异系数均小于6%；线性实验中Fbg、D-D、AT的稀释变异P值均小于P0.05，线性失拟检查G值均小于F0.05；轻至中度黄疸、脂血、溶血对各检测指标的影响度均低于6%；与ACL Futura比对，PT、APTT、TT、Fbg的相关系数r值分别为：0.9751、0.9248、0.9766、0.9901，仅Fbg在各医学决定水平的相对偏差均低于允许误差；本地区PT、APTT、TT、Fbg的参考区间分别确定为：8.811.8秒、2841秒、1217秒、2.04.4g/L。结论 ACL TOP血凝仪具有良好的重复性、稳定性、线性和抗生物性物质干扰能力，与ACL Futura血凝仪常规凝血指标比对结果不理想，需重新建立基于ACL TOP血凝分析系统的项目参考区间。关键词：全自动分析系统；血液凝固；性能评价Establishment and evaluation of ACL TOP automatic blood coagulation analytical system. TANG Ning, CAO Wenjing, XIA Xunsheng, etc, Department of Laboratary medicine, Tongji Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan, Hubei 430030Abstract: Objective To evaluate the performance of ACL TOP automatic coagulation analyzer and establish an optimized coagulation analytical system. Methods According to the documents of Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), we select the tests which represent three analytical methods to perform repeatability, stability, linearity and anti-interference tests and methodologic comparison of ACL TOP to ACL Futura automatic blood coagulation analyzer. Then 250 specimens from healthy population were collected and assayed to determine the reference range for routine tests on ACL TOP. Results The within-run and between-day coefficient of variability (CV) of prothrombin time (PT), activated partial thromboplastin time (APTT), thrombin time (TT), fibrinogen (Fbg, Clauss method), d-dimer (D-D) and anti-thrombin (AT) were both less than 6%, respectively. P values for Fbg, D-D, AT are less than P0.05, according to the linearity test and G values less than F0.05. The extent of influence of low to middle grade of jaundice, fat and hemolysis on each test are all less than 6%. In the comparison to ACL FUTURA, the coefficient of relativity(r value) for PT, APTT, TT and Fbg was 0.9751,0.9248,0.9766 0.9901, respectively. Only the relative error of Fbg on each medical determination level was less than allowed error. The reference range for PT, APTT, TT and Fbg was 8.811.8 s, 2841 s, 1217 s, 2.04.4g/L, respectively. Conclusion The ACL TOP coagulation analyzer has good repeatability, stability, linearity and capability of anti-interference. But the results of comparison to ACL FUTURA are not identical. So it is necessary to determine new reference range for tests on ACL TOP coagulation analytical system.Key Words: Automatic analytical system; Coagulation; Performance evaluation一个标准化实验室引进新的分析仪器及试剂时，必须遵循标准化程序和质量管理的要求建立新的分析系统及进行性能评价，以确保分析系统的正确运行并充分了解其实验性能。ACL TOP全自动血凝分析仪是我院在国内率先引进的美国IL公司生产的新型全自动血凝分析仪，正式投入使用前，根据临床和实验室标准协会（CLSI，原名NCCLS）相关文件的要求，对仪器的重复性、稳定性、线性、抗生物物质干扰能力等进行评价，同时与IL公司同系列的ACL Futura全自动血凝分析系统进行比对，并根据需要建立了本地区凝血常规指标的新生物参考区间。1 材料1.1 仪器：ACL TOP全自动血凝分析仪、ACL Futura全自动血凝分析仪（Instrumentation Laboratory, IL, 美国），仪器操作、维护保养遵循仪器说明书。1.2 试剂：ACL TOP及ACL Futura血凝分析仪均使用IL公司提供的配套试剂；校准品、质控品（IL公司）；胆红素标准品（上海科华公司生产，批号：GF62K）；脂肪乳（主要成分为甘油三酯，华瑞制药有限公司生产，批号：0510019）；血红蛋白（日本国际试药株式会社）。1.3 标本：采用随机的住院病人新鲜全血标本进行线性、生物干扰、携带污染率及比对实验；收集本院体检中心250名健康体检人员全血标本建立生物参考区间。全血标本用真空采血管1:9枸橼酸钠（109mmol/L, 3.2%）抗凝，并于3000rpm离心10min取得乏血小板血浆4小时内完成检测。2 方法2.1 检测项目及方法：包括凝血酶原时间（prothrombin time, PT）、活化的部分凝血活酶时间（activated partial thromboplastin time, APTT）、凝血酶时间（thrombin time, TT）均为凝固法；纤维蛋白原（fibrinogen, Fbg）为Clauss法；D-二聚体（d-dimer, D-D）为免疫比浊法；抗凝血酶（antithrombin, AT）为发色底物法。2.2 仪器项目的校标：用相应的校准品对ACL TOP血凝分析仪上的如PT、Fbg、D-D、AT进行校标，仪器自动按比例稀释校准血浆，建立标准曲线并得出回归方程和相关系数；对于没有标准品的项目（如APTT、TT），通过检测IL公司提供的正常值和异常值质控品，观察其结果是否在质控允许范围内。2.3 重复性实验（批内精密度）：根据CLSI的EP5-A2文件1对于精密度评价的要求，用正常水平和异常水平定值质控品在ACL TOP血凝仪上分别测定APTT、PT、TT、Fbg、D-D、AT，以了解三种检测原理的重复性。由于D-D异常质控品较难获得，使用D-D校准品（D-D = 1050ng/ml）作为异常高值样品。各项指标在3小时内各水平连续测定20次，计算均值（）、标准差（S）、变异系数（CV）。2.4 稳定性实验（日间精密度）：使用重复性试验中的质控品在ACL TOP血凝分析仪上测定APTT、PT、TT、Fbg、D-D、AT各水平，每天测定1次，连续测定20天，计算、S、CV。2.5 线性实验：根据CLSI 2对线性评价的要求，分别选取Fbg、D-D、AT的高值和低值病人标本，低值标本为1号，高值标本为5号，二者3:1混合为2号，等份混合为3号，1:3混合为4号，制备成5个浓度梯度的样品，每个浓度样品随机排列在ACL TOP血凝仪上重复测定4次，根据检测结果进行线性回归分析、稀释变异试验及线性失拟检查。2.6 生物性物质干扰实验：根据CLSI EP7-A文件3对干扰实验的相关要求，采用在体外向正常人混合血浆中加入不同浓度胆红素、脂肪乳、血红蛋白的方法评价ACL TOP血凝仪抗黄疸、脂血、溶血干扰的能力，检测项目为APTT、PT、TT、Fbg，每个浓度水平检测两次取均值作为检测结果，加入的最高浓度参考临床标本可能出现的最高含量及各试剂说明书的说明。根据加入干扰物质前后的测定值计算影响度，影响度=（加入后测定值-加入前测定值）/加入前测定值100%。2.7 与ACL Futura血凝分析系统的比对实验：根据CLSI EP9-A2文件4对能力比对与偏差估计的相关要求，选取凝血时间正常和异常的住院病人血浆40例，分别在ACL TOP血凝分析仪和ACL Futura血凝分析仪上平行检测APTT、PT、TT、Fbg，每天8例血浆，按18，81排序检测两次，连续检测5天。最后对检测结果进行离群点检查、相关性分析及偏差估计。2.8 生物参考区间的建立：收集250名来我院健康体检者标本，年龄186岁，男127例，女73例。在ACL TOP血凝分析仪上检测APTT、PT、TT、Fbg，检测结果经正态性D检验若确定为正态分布，根据均值1.96标准差计算各项目参考区间，否则按百分位数法计算参考区间5。2.9 统计方法：使用SPSS11.0软件分析包。3 结果3.1 重复性与稳定性：ACL TOP全自动血凝分析仪的重复性与稳定性实验结果见表1。各项目批内及日间CV值均0.05，可以认为检测数据呈正态分布（见表5），根据均值1.96标准差的参考区间并结合临床实际，最终确定本室常规项目APTT、PT、TT（5ml）、Fbg的生物参考区间分别为28.041.0 s、8.811.8 s、12.017.0 s、2.04.4 g/L。3 讨论作为最新型的全自动血凝分析仪，ACL TOP全自动血凝分析仪不仅具有高度自动化、快速检测和操控界面先进的特点，还可同时采用凝固法、免疫比浊法和发色底物法检测20多个凝血相关指标。尽管仪器厂商已经提供了仪器性能的初步参数，但由于地区、人种、实验室之间的差异，特别是某些试剂制备工艺、剂型改变后生物参考区间会有显著改变，各实验室引进使用前应重新评估。本研究表明，ACL TOP上各项目批内及日间变异系数均6%，可见该血凝分析仪的三种检测方法均具有良好的重复性和稳定性。线性试验结果表明三种检测方法不仅具有良好的线性，且Fbg、D-D检测中仪器可根据需要自动减少或增加标本稀释倍数，可获得较宽的检测范围。干扰实验中，血红蛋白达1.2g/L对Fbg（Clauss法）影响度6%，血红蛋白达5g/L、甘油三脂达900mg/dl、胆红素达20mg/dl对各指标影响度6%，均远低于美国临床实验室改进修正案88（CLIA88）能力验证分析质量要求对室间评估的允许误差（EA）（PT为15%、APTT为15、Fbg为20），可见该分析系统具有良好的抗黄疸、脂血、溶血等生物性物质干扰能力。ACL TOP血凝分析仪配套试剂一个显著的改变就是PT、APTT试剂中的磷脂由人工合成，PT试剂中的组织因子采用基因工程重组技术制备。因此，与ACL Futura比对发现，两台仪器仅Fbg检测结果同时具有良好的相关性和符合要求的偏差（R值0.975，相对偏差1/2EA）。可见即便为同系列的血凝检测系统，仪器及试剂更换时，也需重新建立各项凝血指标的生物参考区间。本文通过对各年龄段健康体检人群的调查，建立了基于本地区人群及本实验室检测方法的凝血常规项目的生物参考区间。结果表明，与试剂说明书提供的数据有很大差异。说明不同地区人群的生物变异、环境因素、样本量、试剂制备工艺、剂型改变，均对生物参考区间有影响，建立各实验室自己的参考区间十分必要。需要注意的是，计算参考区间时，应先进行数据的正态性检验，确定为正态分布后，才能根据均值1.96标准差计算参考区间，否则按百分位数法计算参考区间。本研究通过对ACL TOP各项性能的全面评价，初步建立了优化适用的ACL TOP全自动血凝分析系统，该系统具有快速、准确、稳定、简便的检测特点，适合现代化大型实验室的工作需要。整个仪器性能评价过程按照CLSI相关文件要求及本实验室相关标准化操作规程进行，符合标准化实验室的质量管理要求。参考文献1.NCCLS.Evaluation of Precision Performance of Quantitative Measurement Methods; Approved GuidelineSecond Edition. NCCLS document EP5-A2 ISBN 1-56238-542-9. NCCLS, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA, 20042. 杨国昌,许叶. 线性评价和干扰实验中NCCLS评价方案的应用J.临床检验杂志,1999,17:184-1853.NCCLS.Interference Testing in Clinical Chemistry; Approved Guideline. NCCLS document EP7-AISBN 1-56238-480-5. NCCLS, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA, 20024.NCCLS.Method Comparison and Bias Estimation Using Patient Samples; Approved GuidelineSecond Edition. NCCLS document EP9-A2 ISBN 1-56238-472-4. NCCLS, 940 West Valley Road,Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA, 20025.金丕焕. 医用统计方法（M）. 第2版. 复旦大学出版社, 2004. p312332表1 ACL TOP血凝仪批内及日间精密度测定结果（n=20）项目批内日间正常水平异常水平正常水平异常水平xSCVxSCVxSCVxSCVPT(s)11.490.110.9641.130.892.1611.470.131.1740.00.862.15APTT(s)29.90.260.8758.40.550.8430.210.471.5559.431.021.72TT(s)14.590.42.7418.760.331.7613.610.564.1217.820.653.6Fbg(g/L)3.490.082.301.110.054.503.420.185.311.130.0595.22DD(ng/ml)115.16.505.65963.319.482.02170.887.124.171075.3842.934.0AT(%)990.650.6614.850.755.1894.503.253.4415.380.925.96表2 ACL TOP血凝仪线性实验结果FbgDDAT回归方程y = 1.0023x - 0.0552y = 0.001x + 0.0165y = 1.0113x - 0.4459相关系数(r)0.99910.99840.9996稀释变异(P)0.4030.3110.349线性失拟检查(G)1.3292.1181.808P0.05=0.684，F0.05=3.29表3 生物干扰物对ACL TOP血凝仪APTT、PT、TT、Fbg检测的影响干扰物浓度APTTPTTTFbg结果(s)影响度(%)结果(s)影响度(%)结果(s)影响度(%)血红蛋白浓度结果（g/l）影响度(%)血红蛋白(g/L)030.910.612.803.1130.7-0.6510.2-3.7712.6-1.55230.9010.2-3.7712.90.