土豆中酪氨酸酶的提取及其催化活性的研究终稿.doc

本科毕业论文（设计）题 目：土豆中酪氨酸酶的提取及其催化活性的研究 学 生： 蒋泽琦 学号： 201040320111 学 院： 生命科学学院 专业： 生物科学 入学时间： 2010 年 09 月 15 日指导教师： 张秋研 职称： 助理实验师 完成日期： 2014 年 05 月 04 日诚 信 承 诺我谨在此承诺：本人所写的毕业论文土豆中酪氨酸酶的提取及其催化活性的研究均系本人独立完成，没有抄袭行为，凡涉及其他作者的观点和材料，均作了注释，若有不实，后果由本人承担。 承诺人（签名）： 年 月 日土豆中酪氨酸酶的提取及其催化活性的研究不同因素对酪氨酸酶活性的影响学位申请人：蒋泽琦 导师：张秋研摘 要 酪氨酸酶从目前的研究看来是一种由Cu+ 或Cu2+作为辅助因子构成的全酶，空气中的氧对多巴的氧化反应就是由其催化的1。而我们可以通过多巴转换反应过程中的颜色变化检测其中的催化过程，所以酶的活性我们可以通过对于吸光度随时间的变化的测定来求得。 本论文则是首先从土豆中提取出酪氨酸酶，而后采用分光光度计法对其的活性进行测定，大约于480nm处使用紫外分光光度计测定土豆提取液的吸光度，将吸光度对于时间的变化率（A/V）作为反应的速率，并以此建立对于多巴溶液的转换动力学曲线，得出酪氨酸的活性2。关键词 酪氨酸酶；提取；活性；活性动力学曲线Extraction and catalytic activity of Tyrosinase potatoesAbstract：From tyrosinase appears to be a current study of Cu + or Cu2 + as a cofactor holoenzyme composed of the oxygen in the air is oxidation of dopa by catalysis. We can convert the catalytic process and reaction process wherein the color change is detected by dopa, the enzyme activity that we can change with time for the measurement of absorbance to obtain. This paper is the first extract from potato tyrosinase, followed by the spectrophotometer its activity was measured at approximately at 480nm using a UV spectrophotometer absorbance potato extract, the absorbance changes with respect to time rate ( A / V) as the reaction rate, and thus create a solution for the conversion of dopa kinetic curve derived tyrosinase activity.Key words：Tyrosinase; extraction; activity; activity kinetics目 录1引言12 材料与方法3 2.1 材料3 2.2 方法3 2.2.1 酪氨酸酶的提取3 2.2.2 酪氨酸最大吸收波长确定3 2.2.3 酪氨酸酶的活性测定3 2.2.4 酶活性因素测量33 结果与分析4 3.1 酪氨酸最大吸收波长确定4 3.2 建立酶的动力学曲线4 3.3 计算酶的活性6 3.4 影响酶的活性的因素研究7 3.4.1 pH值对酶活性的影响7 3.4.2 温度对酶活性的影响7 3.4.3 抑制剂EDTA对酶活性的影响84结论95参考文献101 引言酪氨酸酶（Tyrosinase），简称TYR，是一种75kD含铜的多酚氧化酶，酪氨酸酶非常普遍的存在于微生物、动植物及人体中3。酪氨酸酶在黑色素合成的的过程中是最为关键的酶，是黑素代谢和儿茶酚胺的关键酶，同时也是目前已知的唯一的的黑色素代谢酶，是结构复杂的多亚基的含铜氧化还原酶。酪氨酸酶具有很多的特征性的催化活性，它既可以当做酪氨酸羟化酶、多巴氧化酶，又可以当做5,6-二羟基吲哚氧化酶，在黑色素生成过程中起着非常重要的作用4。对于人体研究来说，它与色素障碍性疾病及恶性黑色素肿瘤的发生与治疗有关。因此对编码酪氨酸酶基因的结构、表达及其调控,以及酪氨酸酶的抑制剂和激活剂的研究，引起国内外的广泛重视。目前，对酪氨酸酶活性中心及其催化功能的研究比较透彻,但对酪氨酸酶蛋白的立体结构尚不清楚5。很多复杂的的有机物合成反应或者分解反应需要在高温、高强酸碱或者减压等很严苛的特定条件下才能进行，而在生物体内，即使在十分温和的条件下，如常温、常压和近中性溶液中，许多复杂的化学反应却能顺利进行，其根本原因就是由于生物酶的存在6。生物酶是我们可以看做一种生物催化剂，通过组成我们一般将之分为两类，一类叫做简单蛋白质，这种酶则是有它的结构来决定其活性，如脲酶、淀粉酶等；第二类则是结合蛋白质酶，这类酶想表现出自身的活性，则要加入一些非蛋白质组分（即辅助因子）。酶蛋白质与辅助因子结合形成的复合物称为全酶7。比如酪氨酸酶就是以铜离子为辅助因子的全酶。被酶作用的物质称为这种酶的底物，而一般一种酶只会催化特定的的一种或一个类型底物的反应，具有很高的选择性和灵敏度，从而受到了广大分析者的重视。酶已作为一种分析试剂得到应用。特别是在生化、医学方面有很高的应用价值8。例如生命物质和流体中的特殊有机成分，用其他方法测定有困难，用酶法分析却有其独到之处。本论文是从马铃薯中提取出来酪氨酸酶，而后将其催化活性通过利用分光光度计来测定。土豆，香蕉，苹果等切开后暴露在空气中一段时间表面会变黑9，是因为这些东西含有酪氨酸和酪氨酸酶，酶存在于物质内部，当把它暴露在空气中时，在氧气的参与下，便会发生一系列反应10，主要的反应过程见图1。Fig.1 The reaction process of casease由于多巴试剂第一步转成多巴红的反应要比下一步产物的速率快得多，因此我们可以利用这个特性通过测定多巴转换成多巴红的速率而间接的测定酶的活性11。因为多巴红具有特殊的颜色，所以我们可以利用分光光度法来测定，通过不一样的时间测得的其中一个波长下的吸光度，以吸光度作为竖轴，时间作为横轴来构建坐标系，而后从算出的直线斜率中求出酶的活性。酶的活性一般定义为在适宜的条件下（一般包括pH值、离子强度、温度等），20时在1 min内转化1 mmol底物所需要催化剂的量为活性单位。从下面的式子中我们可以计算出酶的活性：，式中，为我们所使用的溶液的酶的活性，则是最大吸收波长是的吸光度的变化，t为时间（min），k为多巴红的摩尔吸收系数，V为加入酶的体积，进而计算出原料（土豆）中酶的活性：。式中A为原料中酶的活性（注意此处A不是吸光度A），V0为原料所得的酶溶液的总体积，m为原料总质量。2 材料与方法2.1 材料 仪器：分光光度计（含比色皿）（722型）、离心机（TG16C）、电子天平（BLXK-JA3003B）、组织捣碎机（JJ51-JJ-2 ）、酸度计试剂：多巴（二羟苯丙氨酸）、磷酸氢二钠（分析纯）、盐酸（36%）、酪氨酸、市售新鲜马铃薯、去离子水。2.2 方法2.2.1 酪氨酸酶的提取 取新鲜土豆，清洁干净后切碎，用天平称取10.0 g放在研钵中，加入7.5mL pH=7.2的磷酸缓冲溶液，用力研磨，然后用双层纱布收集滤出提取液，立即使用高速离心机高心分离5 min，倾出上层清液保存于冰箱中，提取液为棕色，在放置过程中不断变黑。2.2.2 酪氨酸最大吸收波长确定：取2.5 mL酶提取液用pH值为7.2的缓冲溶液将其稀释至10mL，摇匀后取出0.4mL已稀释的土豆提取液，加入2.6 mL pH值为6.0的磷酸缓冲溶液，加入2.0mL酪氨酸溶液，摇匀。反应5 min后，使用紫外分光光度计扫描绘制酪氨酸的吸收光谱图。2.2.3 酪氨酸酶的活性测定：分别取0.1 ml、0.2 ml、0.3 ml、0.4 ml稀释过的提取液用pH值7.2的磷酸缓冲液稀释至10.0 ml并摇匀。然后取0.4 mL稀释过的提取液滴入10 mL试管中，加入2.9 mL pH值为6.0的缓冲溶液，再加入2.0 mL多巴溶液，同时开始计时，用分光光度计在480nm处测定吸光度。刚开始的6 min内每分钟读一个数，然后隔2min读一个数，直至吸光度变化不大为止。以吸光度时间绘制曲线，然后通过直线斜率算出酶的活性。2.2.4 酶活性因素测量：2.2.4.1 首先我们使用微量移液器取出1.5 mL稀释过的提取液分别滴入6个10 ml试管中，加入4.5 mL pH=6.0的缓冲溶液，再加入4 mL多巴溶液，通过加入一定量的氢氧化钠溶液和盐酸溶液，而后使用pH=7.2的缓冲溶液定容，将溶液的pH梯度定为2、3、6、7.2、8.2、10，测定溶液的吸光度随着时间变化而得到的数值。2.2.4.2 首先我们使用微量移液器取出1.5 mL稀释过的提取液分别滴入6个10 ml试管中，加入4.5 mL pH=6.0的缓冲溶液，再加入4 mL多巴溶液，然后用pH=7.2的缓冲溶液定容，摇匀分别在水浴0、1530、40、50、60中加热5 min，测定溶液的吸光度随着时间变化而得到的数值。2.2.4.3 首先我们使用微量移液器取出1.5 mL稀释过的提取液分别滴入6个10 ml试管中，加入4.5 mL pH=6.0的缓冲溶液，再加入4 mL多巴溶液，分别加入浓度为0.01827mol/L的EDTA0 ml、1 ml、2 ml、3 ml，然后用pH=7.2的缓冲溶液定容，测定溶液的吸光度随时间变化值。3 结果与分析3.1 酪氨酸最大吸收波长确定：使用紫外分光光度计扫描绘制酪氨酸的吸收光谱图，最大波长分析结果见图2，从图中我们可以看出酪氨酸的最大吸收波长在480nm处。Fig.2 Tyrosine analyte absorption curve3.2 建立酶的动力学曲线 表1为不同浓度酶提取液在不同时间下所测的吸光度，根据表1中的数据不同时间下所测的吸光度建立酶的标准曲线(见图3)，以吸光度A作为坐标系的竖轴，时间T作为横轴，可得出在有了酶的作用之后，酪氨酸转换的动力学过程，再由直线部分算出来酪氨酸转换的速率，从而可以得到酶的活性。Table 1 ：Different concentrations of the enzyme extract at different times of the measured absorbance酶稀释体积 时间（min）0.1ml0.2ml 0.3ml0.4ml10.180.250.360.4920.250.390.590.7730.320.530.741.0340.390.680.901.2550.460.781.021.4860.530.921.151.6880.601.061.261.90100.671.201.332.11120.751.231.352.13140.761.261.402.26160.771.281.422.33180.781.301.432.39200.791.311.452.42220.791.331.462.44吸光度/A时间/minFig.3 The standard curve of tyrosinase3.3 计算酶的活性 Table 2 Measurement of activity of different concentrations of the extract活性/Amin-1原料中酶的活性/g-10.102.811.690.202.851.710.302.931.760.402.891.73平均值2.871.723根据公式a=k/（10-6V2.50.1）（其中k是斜率），由图可知，将K，V值代入公式即可求得提取液中酪氨酸酶的活性（见表2），再用公式A=aV0/m（其中V0=2.5ml、m=10.0g，是原料土豆的总的体积和重量）进而得到土豆中的酪氨酸酶的活性。3.4 影响酶的活性的因素研究：3.4.1 pH值对酶活性的影响不同pH下酪氨酸酶的活性见表3和图4。由图4可知，在pH=2或10时，我们可以看到溶液的吸光值不变，这种情况一般是酶在该环境下已经丧失了活性，没有了本身的催化效果。Table 3 Different pH tyrosinase activitypH2.03.06.07.28.210.0吸光度A0.250.3650.4930.5620.5490.302Fig.4 The effect of pH on enzyme activity3.4.2 温度对酶活性的影响不同温度下的酪氨酸酶的活性见表4和图5。由图5可知，温度不同时，酶的反应活性也不同，说明酶参与反应时有一个最适当温度，最适为40左右。Table 4 Different temperatures the activity of tyrosinase温度（T/）2030405060吸光度A0.3460.3880.4850.3020.275Fig.5 Effect of temperature on enzyme activity3.4.3 抑制剂EDTA对酶活性的影响不同浓度的抑制剂EDTA对酪氨酸酶的活性的影响见表5和图6。由图6可以得到，加入了抑制剂EDTA后，吸光度发生了明显的下降；当EDTA的浓度体积大于1ml时，吸光度有逐渐上升。Table 5 Activity of different concentrations of EDTA on tyrosinase inhibitorsEDTA体积/ml01.002.003.00吸光度A0.5150.4850.5130.522Fig.6 Activity of different concentrations of EDTA on tyrosinase inhibitors4结论 本论文从土豆中提取出酪氨酸酶，而后采用分光光度计法对其的活性进行测定，将吸光度对于时间的变化率（A/V）作为反应的速率，并以此建立对于多巴溶液的转换动力学曲线，从而得出酪氨酸的活性。1）使用紫外分光光度计测定土豆提取液的吸光光谱得到提取物最大吸收光谱为480nm；2）由不同浓度酶提取液在不同时间下所测的吸光度值建立酶的标准曲线，再由直线部分算出来酪氨酸转换的速率，从而可以得到酶的活性3)酪氨酸的活性受到很多因素的影响，在pH为中性条件下活性最高，最适宜的温度为40左右，EDTA对它也有很明显的抑制作用，酶自身的浓度也是影响它的活性的一个重要因素。对于这些的研究都让我们对酪氨酸酶有了更深一步的认识与了解。参考文献1 李航，赵国华，阚建全，陈宗道. 天然产物对酪氨酸酶的抑制及抑制理的研究进展.日用化学工业.2003（06）2刘晓丹,黄璜,陈清西. 苯甲酸对蘑菇酪氨酸酶抑制作用机理的研究J. 厦门大学学报(自然科学版). 2003(01)3余霞 张卫明 孙力军.千金子不同极性部位对酪氨酸酶活性的影响.中国野生植物资源.2011（01）；4李昌生 闫军 .21味中药对酪氨酸酶活性影响的研究 . 中药材. 2002（03）5李文 华李芬 李世东 刘某承.生态学