NEB-T4-DNA-Lagase注意事项.docx

一、关于NEB M0202 T4 DNA 连接酶的使用方法和常见问题及解答1、产品特性和使用方法产品说明：该酶催化契合的双链DNA或RNA的5-磷酸末端和3-羟基末端形成磷酸二酯键。该酶不仅能够催化平滑末端或粘性末端DNA之间的连接，还可以修复双链DNA、RNA或DNA/RNA杂交双链中的单链切口(1)。-来源： 源于E.coli C600 pcl857 pPLc28 lig8 (2)。应用：限制性酶切片段的克隆 (3)。将linker或adapters 连接到DNA片段的平滑末端。反应缓冲液： 1X T4 DNA Ligase Buffer:50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP, 25 g/ml BSA, (pH 7.5 25C)。推荐DNA浓度(0.1 - 1 M 的5末端)。使用注意：ATP是反应必须的辅因子。这一点与要求NAD作辅因子的大肠杆菌DNA连接酶不同。如在反应体系中补加1 mM的ATP，连接反应还可以在NEB提供的四种限制性内切酶缓冲液(NEBuffers)或在T4 DNA多聚核苷酸激酶缓冲液中进行。质量保证： 无核酸内、外切酶污染。每批T4 DNA连接酶均通过模拟克隆实验进行检测，该实验可以检测出待连接DNA末端的任何破坏。结果表明99.9%的DNA末端未受任何降解。单位定义(粘性末端活性单位）：在20l连接反应体系、0.12M (300g/ml)的5-末端浓度条件下，16C反应30分钟，能使50% 的经Hind 消化的DNA片段连接所需的酶量定义为一个NEB单位。一个粘端连接活性单位=0.015个韦氏（ATP-PP交换）单位(4)。一个韦氏单位=67个粘端连接活性单位。浓度：400,000 units/ml和2,000,000 units/ml。贮存条件： 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 200 g/ml BSA和50%的甘油，-20C贮存。热失活条件: 65C 加热10分钟。室温连接反应：为方便起见，连接反应可以在室温（20-25C）条件下进行。粘性末端连接：在20l反应体系中加入1l T4 DNA连接酶，反应10分钟。平滑末端连接：在20l反应体系中加入1l T4 DNA 连接酶反应2小时，或者加入1l高浓度T4 DNA 连接酶反应10分钟。另外，NEB的快速连接试剂盒 (Quick Ligation Kit, NEB #M2200V 15个反应)是独有的可以在室温5分钟条件下连接平滑末端和粘性末端的试剂盒。图1：在25C条件下，用1 unit（1:400稀释后取1 l）T4 DNA连接酶连接DNA/Hind 片段(4-碱基粘端)不同反应时间的结果。 图2：在20 l反?逑抵校?貌煌?康腡4 DNA连接酶连接平滑末端的DNA/Hae 片段。16C温育30分钟。图2：在20 l反?逑抵校?貌煌?康腡4 DNA连接酶连接平滑末端的DNA/Hae 片段。16C温育30分钟。二、常见问题及解答Q1：有哪些潜在原因可导致用T4 DNA连接酶连接后转化失败?A1：l反应体系内无ATP或Mg2+可导致连接失败：使用随酶提供的buffer或向其它兼容的buffer中加入ATP。含ATP的Buffer保存超过1年，其内ATP可能会降解，导致连接失败。当补加ATP时，确定补加的是核糖核酸ATP，而不是脱氧核糖核酸ATP，因为后者不起作用。l反应体系中盐浓度过高或EDTA含量高都可导致连接失败：纯化DNA。l去磷酸化步骤完成后，CIP、BAP或SAP失活不彻底：根据厂家推荐的方法去除去磷酸化酶。lDNA浓度过高导致连接后产生的均是线性DNA：保持总DNA浓度在1-10g/ml之间。l连接末端为单碱基突出末端：使用最高至5l高浓度连接酶16C过夜连接。l插入片段和质粒没有磷酸化。注意：如果载体已经去磷酸化了，而引物又没有磷酸化会导致连接失败，订购磷酸化的引物或对引物进行磷酸化。l加入过多的连接混合物至感受态细胞：50l感受态细胞应加入1-5l连接混合物。l插入片段太大，不能进行环化：降低插入片段的浓度，并使用高浓度连接酶16C过夜连接。l连接酶失活：用lambda HindIII或其它可行的底物进行检测。l连接混合物含有PEG且连接反应过夜：长时间地在含有PEG的条件下连接可导致转化效率降低，这可能是由于逐渐产生的大片段线性DNA抑制了转化效率。快速连接试剂盒（NEB# M2200）的buffer含有PEG。l电转化前没有提纯连接混合物：电转化必须去除buffer，否则盐会导致瞬间放电，击穿细胞。可用透析或柱纯化的方法纯化连接混合物。虽然快速连接试剂盒（NEB# M2200）buffer中含有的PEG不会导致击穿细胞，但是会抑制电转化，所以必须去除，可用柱纯化方法去除PEG。Q2：解决转化问题时，还有什么因素需要考虑？A2：l感受态细胞出了问题：设置下面列出的实验对照，必要时更换新鲜感受态细胞。l细胞不是感受态：设置下面列出的实验对照，必要时更换新鲜感受态细胞。l大肠杆菌不能很好的接受重组蛋白：试用pMAL系统（NEBE8000S）表达MBP(麦芽糖结合蛋白)融合蛋白，或者试用其它不需要大肠杆菌的表达系统。l连接的DNA片段含有反向重复的序列，不能用大肠杆菌筛选：如果可能去除重复序列，或试用其它不需要大肠杆菌的表达系统。l插入序列来自哺乳动物、植物或者含有甲基化的胞嘧啶，会被很多大肠杆菌菌株降解：使用mcrA、mcrBC 和mrr缺失菌株。l重组子太大（10,000 bp）不能进行化学转化：用电转化。Q3：内切酶酶切反应后，有什么因素可以导致T4 DNA连接酶连接和后续的转化失败？A3：l内切酶酶切不充分：如果酶切位点位于PCR产物的末端，识别位点末端侧需要加至少6个保护碱基。用对照底物检测内切酶的活性。l内切酶没有完全失活：如果内切酶不能热失活，用酚/氯仿抽提纯化DNA。l内切酶的星号活性消化了载体或插入片段：跑胶检测DNA，如果存在多余的条带，减少内切酶使用量或减短反应时间。lDNA或内切酶有外切酶或磷酸酶的污染，破坏了DNA末端：酚/氯仿抽提纯化DNA。检查内切酶的质量检测资料和注意事项，如果连接QC不佳或外切酶活性高，减少内切酶量或縮短反应时间。Q4：使用T4 DNA连接酶，需要设置什么对照来检测细胞和DNA。A4：注意：每个对照组都使用相同浓度的DNA，一般为0.1-1.0ng/转化。l转化空载体（未切割的）至感受态细胞，目的：检测感受态细胞的质量以及质粒的抗性。分别涂布于含有和不含有抗生素的平皿上。l转化线性化后的载体，目的：检测未切开质粒的量，克隆数应该小于步骤1的1。l酶切再连接质粒，目的：检测连接酶的活性以及DNA末端的完整性。克隆数应该与步骤1相近。l酶切后去磷酸化再连接质粒，目的：检测未完全去磷酸化的背景。克隆数应该小于步骤1的1。Q5：什么情况下选用T4 DNA连接酶？A5：T4 DNA连接酶应该被用来连接粘性末端（室温10分钟）或平末端（室温2小时），或者连接反应需要过夜。如果需要热失活连接酶，选用用T4 DNA连接酶。高浓度T4 DNA连接酶被用来连接单碱基突出末端，或连接需要长时间孵育来环化的大片段，比如BAC（细菌人造染色体）结构。Q6：T4 DNA连接酶能与快速连接buffer兼用吗？A6：可以，高浓度T4 DNA连接酶可以直接取代，如果是普通浓度的T4 DNA连接酶，将孵育时间从5分钟延长到15分钟。不要进行热失活，因为加热会让buffer内的PEG抑制转化。反应时间延长也会降低转化效率。Q7：T4 DNA连接酶连接应该加多少DNA？A7：单位定义用的是0.12 M (300 g/ml) lambda HindIII。高浓度的DNA用于linker的连接。为了促进环化（有利于转化），应该控制总DNA浓度于较低水平。载体片段总浓度应为：1-10 g/ml。插入片段和载体的摩尔浓度比介于2-6之间，比例低于2:1会降低连接效率，高于6:1会促进形成多个插入。如果对DNA的浓度不确定，可以做不同比例的多个连接反应。Q8：T4 DNA连接酶可在其它NEBuffers中使用吗？A8：连接可以在内切酶所有4个标准buffer和T4多聚核苷酸激酶的buffer中进行，但需要加终浓度为1mM ATP。确定补加的是核糖核酸ATP，而不是脱氧核糖核酸ATP，因为后者不起作用。当使用NEBuffer 3时，如果DNA中盐浓度较高可导致连接效率下降。Q9：T4 DNA连接酶可以热失活吗？A9：可以，65 C孵育20分钟可以失活。如果buffer【快速连接试剂盒（NEB# M2200）内的buffer】中含有PEG则不可热失活，否则会抑制转化。Q10：Weiss单位（韦氏单位）与NEB粘性末端单位如何换算？A10：一个NEB粘性末端单位等于0.015 Weiss单位，即一个Weiss单位等于67个NEB粘性末端单位。二、关于NEB M2200 T4 DNA 快速连接试剂盒的使用方法和常见问题及解答1、产品特性介绍以及使用方法产品说明：本试剂盒可在室温(25C)5分钟条件下，完成DNA片段粘性末端或平滑末端的连接反应。应用：DNA片段克隆入载体文库构建TA克隆Linker连接线性DNA的再环化快速连接试剂盒的优点：快速-粘性末端或平滑末端DNA片段的连接只需5分钟即可完成方便-可在室温条件下进行连接反应灵活-适合于各种常规连接反应试剂盒成分：Quick T4 DNA 连接酶(重组酶)2X Quick Ligation Buffer贮存条件 (连接酶)：50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 200 g/ml BSA和50%甘油。2XQuick Ligation Buffer：132 mM Tris-HCl，20 mM MgCl2，2 mM ATP，15%Polyethylene glycol(PEG 6000)*， pH 7.625C。* 美国专利号：4,582,802。注意：连接缓冲液用前彻底混匀，避免反复冻融。快速连接步骤:混合50 ng载体和3倍摩尔量的插入片段，用蒸馏水调整总体积为10 l。加入10 l 2Quick Ligation Buffer，混匀。加入1 l Quick T4 DNA连接酶，彻底混匀。稍事离心，室温 (25C) 作用5分钟。冰上冷却，然后转化或贮存于-20C。不要热失活。热失活会急剧降低转化效率。转化步骤：快速连接产物可通过几种不同的方法进行转化，NEB推荐下述转化方法：冰上融化感受态细胞。在1.5 ml微量离心管中，将约5 ng (2 l)的连接混合物冷却。在DNA样品中加入50 l感受态细胞，通过反复吹吸温和混匀样品。冰上放置30分钟。37C热休克2分钟，冰上冷却5分钟。加入950 l室温培养基，37C温育1小时。取100 l样品铺在适宜的培养基上。37C培养过夜。注意事项： 用快速连接试剂盒能使大多数连接反应在25C 5分钟达到反应终点, 超过这个时间效果并不会更好。事实上，连接两小时后转化效率便会降低，如果25C反应过夜，则转化效率会降至75%。待连接的纯化DNA片段可以溶解在双蒸水（最好是Milli-Q超纯水）、TE或其它稀释缓冲液中。要获得最适连接，在加2 Quick Ligation Buffer前，调整载体DNA和插入片段的体积到10 l。DNA片段体积大于10 l的，则相应增加2 Quick Ligation Buffer的体积使之占总反应体积的50%，同样，DNA连接酶的量也要加大。为保证有效连接， 总的载体DNA+插入片段的浓度应当在1-10 g之间。对单插入来说，插入片段:载体比例在2-6之间最好, 低于2:1就会导致低的连接效率, 高于6:1则会导致产生多个插入。如果DNA片段的浓度不能确定，就以不同的比例做几个连接反应。电转化可以使转化效率提高几个数量级。在用快速连接反应产物做电转化以前，一定要降低PEG浓度。我们推荐使用柱离心式DNA纯化方法。连接进程曲线：LITMUS28载体(NEB #N3628)经EcoR切割(平滑末端)或Hind 切割(粘性末端)后，小牛肠碱性磷酸酶处理、胶回收纯化，作为连接载体；插入片段来自X174 DNA的Hae 消化产物(平滑末端)或DNA的Hind 消化产物(粘性末端)，分别以3:1的插入片段:载体比例按照快速连接程序进行连接。连接产物转化入化学方法制备的大肠杆菌DH5感受态细胞，在LB-amp平板上37C生长过夜。限制性酶切片段的克隆 (3)。2、快速连接试剂盒常见问题及解答Q1: 在应用快速连接试剂盒时，什么原因可以造成不完全连接或转化？A1:可能的原因有：快速连接反应被热失活了。快速连接缓冲液中含有PEG，热失活后会抑制转化。快速连接混合液在电击之前没有纯化。快速连接缓冲液中含有的PEG会阻止电击反应。可以应用商业化的DNA纯化柱纯化连接产物。过夜孵育进行连接反应。连接时间过长，快速连接缓冲液中存在的PEG就会降低转化效率。连接反应时间超过30min，也不会获得更好的效果。反应体系中盐浓度过高，抑制了连接或转化反应。可以纯化一下DNA。脱磷之后，所用的磷酸酶（CIP，BAP或SAP）没有完全失活或去除。可以按照推荐的操作来进行以去除磷酸酶或者选用热敏磷酸酶（NEB#M0289）。因为热敏磷酸酶在65 5min即可完全失活而无需纯化DNA。另外一些影响因素：缓冲液超过一年，其中的ATP已经降解。补加新鲜的ATP至终浓度为1mM。DNA浓度过高，连接产物只有线性分子。建议总DNA浓度在1-10 g/ml之间。插入片段和载体没有磷酸基团。感受态细胞中加入的连接反应混合物过多。建议用量： 50l 感受态细胞中加入1-5l混合物。插入片段长度超过10 kb，反应条件无法满足环化要求。可以降低插入片段浓度。限制性内切酶切割不完全。当用于PCR产物末端的切割时，建议在两端的酶切位点上加至少6个保护碱基。限制性内切酶没有完全热失活。如果选用的内切酶不能被热失活可以用酚/乙醇纯化DNA。内切酶消化过程中存在星活性，造成载体或