番茄线粒体解偶联蛋白基因(LeUCP)沉默对番茄光合作用、呼吸作用及抗逆性的影响-硕士论文

分类号：埋 洳专：j 、唼 单位代码： 学号： 1 0 3 3 5 2 0 8 1 6 0 8 1 硕士学位论文 番茄线粒体解偶联蛋白基因( 三P 沈P ) 沉默对番茄 光合作用、呼吸作用及抗逆性的影响 E f f e c t so ft o m a t 0m i t o c h o n d r i a lu n c o u p l i n gp r o t e i n 伍P 已g e n es i l e n c i n go np h o t o s y n t h e s i s ，r e s p i r a t i o n a n ds t r e s sr e s i s t a n c ei nt h el e a v e so ft o m a t o 申请人姓名： 割自桂 指导教师： 睑量抠熬援 专业名称：蔬苤堂 研究方向： 撞堑生篮发直调控 所在学院： 盛些生生堑拉盔堂瞳 论文提交日期至Q ! ! 月兰月 i ；。一j j ”：一”= 了= Z Z ：”善一誓：_ # 一一i 4 曩一：。j ：= 翟j l j 9 7 j 一，二l “= ：最i j i 。曼：j 爱二；二0 i 童，? 二：c “，”。；。二鼻”：龟一，i 。一品五矗：。盎菇，、i 一一一。一- ； 番茄线粒体解偶联蛋白基因( 三P 玖7 ) 沉默对番茄光 合作用、呼吸作用及抗逆性的影响 论文作者签名： 指导教师签名： 论文评阕人l ： 评阅人2 ： 评阅人3 ： 答辩委员会主席： 委员1 ： 委员2 ： 委员3 ： 答辩日期： 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得浙江太堂或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意 学位论文作者签名：签字日期：年月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解浙江太堂有权保留并向国家有关部门或机 构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅本人授权浙逛太堂 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 签字日期：年月 日 导师签名： 签字日期：年月 日 浙江大学硕士学位论文致谢 致谢 两年多的研究生求学生活即将结束，站在毕业的门槛上，回首往昔，一切的 付出都是值得的。两年的时间很快就过去了，我在人生最重要的时期在3 8 3 实验 室不仅学到了知识，也学到了怎样做人做事。 能够成为喻老师的学生，这份师生缘分让我十分珍惜。我最敬佩的是喻老师 对科研的热爱，比学生来的早离开的晚，周末依然在工作喻老师忘我的工作作 风、执着的科研精神无不深深感染着我。借此机会向喻老师表达我最真诚的感谢， 并祝您身体健康! 在研究生学习阶段，我最应该感谢的人除喻老师外应该是博士后陈双臣师 兄，不论是论文的选题、实验内容进展还有论文的撰写都离不开陈师兄的帮助 陈师兄的身上有太多的东西值得我去认真的学习，感谢陈师兄对我的帮助和包 容，我其实应该称呼你陈老师的，“陈老师，谢谢您! ” 我还要特别感谢师恺老师、周艳虹老师和夏晓剑师兄对我实验的指导和帮 助 感谢研究生期间已经毕业的姜玉萍师姐、汪季涛师兄、张开明师姐、崔金霞 师姐、于海静师姐、顾敏师姐、付丽君师姐、吴静雪师姐和周杰、汪学敏及3 8 3 实验室师妹师弟对我实验上的大力帮助感谢我的室友朱丹、刘娜等对我生活上 的关心 最后我要特别感谢我的家人在我这么多年的学习生涯中给我的厚厚的爱和 支持，你们是我心中最重要的人，是我前进的动力 刘自梅 2 0 1 1 年3 月于华家池畔 哆絮擎掰州制忡簪母懒恻踯剌蝴唧2 瀚自拇* * 晰愕舯孽”惮雒揖群驯辅耕鞘嘟捌鞫* 蹦”鼎啊舯嘟咐埘船黼椎M 哪惮槲淞啊琳锄_ 姗n 褂惴嗍 搿黼獬嘣删蜘舯黜伴州锶研钎船* 州”# 荆耕嘞州日靴擗梯咿州种黼螂即嘲目噶常嗍鳓御州辔螂m w 一_ 喇嘛翘* 商商辫州嘞弼聊嘲画涵嗍帮。自噼# ，瑚# 耐虹 一，：“I 世：三一。一：L 、J _ - 一”。5 。+ ? 、：，争：、，j 2 ：? 一。一一一。= = j 一一一一 一 ：+。H h u ，一1 一嚅盘+ 一： ：j ：i ，：- 世；。二乳“ ，o 一or + ：一謦? f o t 女，：- ， 浙江大学硕士学位论文中文摘要 摘要 植物线粒体是进行呼吸作用为细胞提供能量的重要场所，其在感知外界逆境 信号，调控植物抗逆防御反应中也扮演着重要的角色植物线粒体对氧化胁迫的 消除机制除存在交替氧化酶为末端氧化酶的交替电子传递链路径外，还可以通过 线粒体解偶联蛋白u c P s 来减弱活性氧的产生。研究发现，彳f 明四J 基因对低温、 干旱等氧化胁迫抗性以及有效的光合作用均起着积极的作用。然而其对蔬菜作物 的调节及在抗逆中的作用机制尚不清楚。因此，研究u c P s 基因在调节植物光合、 呼吸作用及在抗逆反应中的作用机制无疑具有非常重要的科学和现实意义 本文以烟草脆裂病毒( T R 和番茄为材料，选择八氢番茄红素去饱和酶基因 作为参照基因，构建了T R V - 如尸! D S 和T R ：V z e 耿碧重组质粒，建立了厶删姆 和髓驮1 尸基因V I G s 体系，厶P D s 基因沉默植株的叶片出现典型的光漂白现象； 比伙，基因沉默植株其基因表达量显著降低 利用T R v - k 献1 P 基因沉默植株，研究了番茄k u C 尸基因对光合参数以及 相关酶活性、荧光参数、电子流分配的影响，分析了如U C r P 基因对线粒体呼吸、 活性氧积累、交替氧化酶的影响。结合三羧酸循环中的顺乌头酸酶活性和柠檬酸 含量及氧化还原状态以的变化，探明线粒体解偶联蛋白对R e d o x 状态的影响 在P Q 和高温逆境条件下，探明线粒体解偶联蛋白在氧化胁迫下是否起到保护作 用所得主要结果如下： l 、研究了番茄厶驮1 P 基因沉默对光合作用的影响。结果表明，1 r I W 病毒 载体侵染未引起番茄植株生长表型差异；基因沉默植株叶片在不同光照强度下的 光合速率均低于对照植株，P n 、彳s a t 、比，l 似值降低，气孔导度G s 提高，但对 C i 无明显影响。番茄厶矾碧基因沉默植株R u b i s C 0 和F B P 勰e 酶活性受抑制，分 别降低了2 3 3 和2 0 3 。 2 、研究了番茄k u c P 基因沉默对叶绿素荧光参数的影响。眈u c r 尸基因表 达量的降低对F 帅m 无明显影响，但降低了光化学猝灭系数( q P ) 和电子传递速率 E T R ，与M o c k 处理植株相比q P 值降低了5 4 。提高了非光化学猝灭系数N P Q ， 并且明显降低了州P s I I ) 和分配于联P c R ) 与屁俨a 的比例以及N A 帆A D H 比值说明厶u C P 基因编码的线粒体解偶联蛋白对有效的光合是必需的，可能 浙江大学硕士学位论文中文摘要 通过影响卡尔文循环关键酶、重新分配P s I I 的电子流比例、降低电子传递速率 和光呼吸而起作用 3 、研究了番茄眈u 凹基因沉默对呼吸作用和R e d o x 状态的影响基因沉 默植株线粒体总呼吸和交替呼吸下降明显，抑制彳似，基因家族的基因表达，其 中对彳D 魍口基因表达量影响显著厶矾? 基因表达量的降低影响还原态泛醌的 含量和丙酮酸含量，分别较M o c k 下降了5 4 3 和2 9 1 ，表明线粒体交替氧化 酶和解偶联蛋白两者呈协同表达关系三羧酸循环中的顺乌头酸酶活性和柠檬酸 含量与M o c k 相比分别降低3 4 6 、1 4 4 N A D H 含量增加且N A D + N A D H 明 显下降，表明线粒体解偶联蛋白对维持蹦o x 状态起一定作用 4 ，研究了P Q 和高温氧化胁迫下解偶联蛋白基因的响应。与M o c k 和T R V 组植株相比，k 伙，基因沉默诱导了植株叶片H 2 0 2 和0 2 的积累，并且在P Q 和高温胁迫处理下，R O S 积累显著增加，其中P Q 处理后H 2 0 2 和0 2 。分别较M o C k 增加4 4 6 7 和2 3 。P Q 胁迫后造成了严重的氧化胁迫，F 、佰m 明显下降，M D A 含量增加C 4 刀、C z 刀、舳D 、删、G R 、m D 基因表达量提高，但 T R V 也P ( 厂C P + P Q 仍然低于M o c k + P Q 与1 r I W + P Q 与M o c k 相比，P Q 处理植株 提高了A s A 、G s H 的含量，并且A s A D H A 、G s H + G s s G 也有所增加，但 T R V _ P ( ，c P + P Q 处理植株叶片缸A 含量和G s H 含量均低于M o c k + P Q 与 T 1 w + P Q 处理，进一步表明k 【，四对维持R e d o x 信号平衡和增强氧化胁迫抗性 具有重要作用 关键词：番茄，解偶联蛋白，光合作用，呼吸作用，逆境响应，氧化还原信 号，活性氧 一。 I 孽攀鬻隳孽箩翼暨警塑警孽笋警算警孥孽孽篓嘲孽箪警黧篓磐爹鹱碧黧雾嚣爱熏凳登擎孽受蹩鹫 浙江大学硕士学位论文英文摘要 A b s t r a c t P l 觚tm i t o d l o r l d r i o ni sm ei I I l p o r t a n tp l a c et 0p r o v i d e e I 魄翟；yf o rc e l lr e s p i 枷o n np l a y s 锄i I I l p o r 觚r o l ef b rp l 锄t j si I lp e r c e i v i n gi I ls 臼e s ss i 印a l ，r e g u l a t i n gn l e d e f m s er e s p o I 玛e N o to l l l yp l a n tm i t o d l o n d r i a la l t e r 衄t i V eo x i d 嬲ee l e C t r o n 仃龇塔p o r t c h a i l li nm em e C h a l l i s mo fo x i d a t i V es 仃部s ，i ta l S 0p o s s e sm i t o d l 0 】嘣r i a lu n C 0 u p l i I 培 p r o t e i 】陷t 0d o c r e 懿e 删V eo 酗，鬻ms p c c i 鹤R e c e n ts t u d i 鹤f 砌t h a t 彳f 几：P ，g 伽哈 p l a y 锄a c t i v er o l ei na b i o t i C Ss 缸销st o l e r a n c et 0l o wt 蹦哪啪加r e d r o u 曲t 锄do m e r o 虹d a t i V es 竹骼s 觚de f f 文；t i V e p h D t o s ”l t l l 髓i s H o w e V e r ，t h em e c ：h a I l i s mi n l e 哪l a t i o nf I l n c t i o nf 0 I t l l ev e 咖b l e 啪p sa n di t sr o l ei n 妣s s 嘲i s t a l l c em e d t l a l l i s m a r en o tc l e 缸1 1 1 盯e f 0 r e ，i ti s 孕e a ti I I 】蝉I n a I l t 0i I 嗍t i g a t eI 栅l 锄i 锄0 fp l a n tU 凹 g ei nm er e g m a t i o no fp h o t o s y I l m 伪i s ，r e s p i 洲o n 缸dt l l er e 剃o ni n 妣s s t 0 1 a 馏1 1 c 宅 h lt h i ss 砌y t o b a C c 0m 仕l e 讥n 璐a n dt o m a t 0p l a n t s ( 二矽叩鲫函一D 万 劣侧彪玎砌聊M i l l “Z O I l 弘a9 ) w e r eu S e dt 0c 0 璐饥l c t 缸l e 静圮s i l e I l 商唱v e c t o r c 哪恤；m c 的鲫饥to f 三护粥趾d 三P 卿g 黜V I G S 仃娜f 0 皿s y s t 锄o f 屁尸! 粥 a n d 上启玖? g 朗船w e r e 销t a b l i s h e d 1 1 地s i l 锄C i n go fn l er e f a 坝啪：蹦l e 厶炉D S 印p e a r e di I lp h o t 0 - b l e a c h e dy o 岫gl e a v 销；I m P C Ra n a l y S i sS h o w e dt l l a t 如U C P 静璩 w 勰d e 伊a d e ds i 嘶f i c a m l y T R V - k 唧g 锄es i l e n c 崦p l 孤如w e r e 惦e dt 0s 伽y 恤e 胁m i t o c h o n “a e 【，C Pg e n e so f p h o t 0 剐n 1 血e t i cp a m m e t e r s a n dr e l a t e d e I ：忆y m 懿a C t i v i t 弘n u o r 懿c e n ， e l e c 们nn o wd i s t r i b 砸0 n M i t o c h o n 荫ar e s p i r a l t i o 玛渤c t i v e o x y g e I l s p e c i e s a 舢u l a t i o n 锄da l t e m a t i v eo x i d a s e ( A O 的、骶a l s 0 觚a 1 ) ，z e d n ee 髓c t so nr e d o x s t a t eo fm i t o c h o l l d d a lu n c o l l p l h 培p r o t e i l lw e r cs t u m o dc o m b i n a t i o n 、以n la c o I l i t a s e c i t r i ca C i dc o r l t e n ti l l 地鼬e b sc y c l ea 嘶v i 锣a n d 川o xs t a t ec h 锄g e S U n d e rP Q 锄d 1 l i g ht 伽叩e r a t l l r e 蛐r e s s ，廿l er o l e so fm i t o c h o n 缸a lu n c o u p l i n gp r o t e i ni no x i d a t i V e s t r c s sw e r ea l s oi n V e S t g a t e T h ef o l l o w i I l ga r et l l em 旬o rr e S u l t s ： 1 T I l ee 仃e c t so ft o m a t 0 如U C P 蹦旧s i l e I l c i n g p h o t o s 蛐懿i sw 讹 e x 锄i n 酣i n l ep r 鹤僦s 硼y N op h a l o t y p i cd i 任相l c e sw e f ed e t e c t e di l l l eg r o w t h I V 浙江大学硕士学位论文 英文摘要 o ft o n l a t 0p l 孤t si n f e c t e dw i 也州口唧访r a lV e C t o r 1 1 1 ep h o t o s y I l m e s i sr a t ei I l m el e a V e so f 幻U C Pg e n es n e I l c i n gw 够l o w c rm 孤t h ec o n 仃D 1p l ；m t su n d e rd i 触 l i 出n e l l s i t i 鹤N e tP h o t o s y n t h e t i cr a t e ，彳s 如比研瓤V a l u 鹤d e 潞e ，s t o m a t a l c o n d u c t a n c eh 财e 嬲ew i n l 比狄g c n es i l e I l C e H o w e v s i 嘶f i c a n te 侬晓sw 盯e 0 b s 讯稍0 ni m e r c e l l u l a rC 0 2c o n ce I l _ t f a l i o nb e 咐e d i f I 研e n t 价a 恤e n t s A 嘶、r i t ) ro f R u b i s c 0a n dF B P 弱e0 ft o m a = c 0p l a l l ：t Sw i 吐lk 伙Pg e I l eS i l 胁d n gw 弱i l l l 】曲i t e d ，i t d f e 硒e db y2 3 3 a 1 1 d2 0 3 阳s p e c t i V e l y 2 W el M l v es t l l d i e dt o m a t 0 上，e U C Pg e n eS i l e I l c i n g 0 nm eC _ 1 1 1 0 r o p h y l l n 麟c e I l p a r 锄栅比唧g e e x l ) r c s s i o n 同u C eh a d e f f 鳅o nF V F m ， b u td e 。勰e dp h o t o c h 翩缸c a lq u 舳c ：h i n ga n de l e c t r o n 劬血S p o r tr a t e C o m p a r e d 诵m m o c k 们a t n l e n tp l a n t sq Pv a l 吣d e c r e 弱eb y5 4 M 伽吣临l e n - p h o t o C h e I I l i c a l q u c h 吨趾d 沈( P S I I ) ，m ed i s m 们o no f 儿( P C R ) a n d 如( P C O ) 觚d m e 础oo f N A D + N A D Hr 抓ow e r es i 砸f i c a n n yr e d u c e d T h er e s u l t sd 锄。璐仃a t e dm a t 厶驭，g e 鹏i sn e c 髓s a D ，蚤we l j c - e c t i v ep h o t o s y I l m e s i s 厶献1 尸g 啪em a yp l a yar o l e 恤D u g h 硼u d n gC a l v i I lc y c l ek c y 印z y m e sa c t i v i t i 髂，静d i s t r i b 砸n go ft l l e p r o p o m o no f P S I Ie l 蜘n o w 蛐ge l e c 仃o n 仃a 鸺f 旨a n dl i g h tr e s p i r a l t i o nr a t e 3 M i t o C h 0 劬诫艮唧g 黜s i l 锄咖gs i 班f i c a n t l yd e C r e 弱e dr e s p i r 砒i o n 姐d a l t 锄删v cr e s p i m t o D r 锄di I l ：I l i b i t e do f 彳似7 蹦l e 铷 I l i l y 甑p r e s s i o 玛e s p e c i a l l y 彳D 朋口g 锄ee x p r 懿s i o n U C P 鲈l es i l e n C i I l g 硎u c ec o n t e n to fu b i q m n e 趾d p y r 嘶ca d d ，砌c hd e c r e 嬲e db y5 4 3 锄d2 9 1 r e s p e c t i V e l yc o m p a r e d w i n lM o c k 觚d ni 1 1 d i c a t e dt h a tm i t o c h o n d r i a la l t 锄a t i v eo x i d 硒e 觚d 姐c o u p l i l l gp r o t e i n e x p 代s S i o na p p e 盯s ) ，I l e 呼s t i c C o m p a r e dw i t l lm o c k ，a c o I l i t 晒ea c t i v i t ) r 觚dc i t r i ca C i d c o n t e n td e 巴弱e d 弱3 4 6 ，14 4 r e s p e 嘶V e l y N A D Hw 勰i I l e a s e d 锄dN 铷D 十 N A D Hd e c r e 嬲吐i ts l l o w e dm i t oc ： l o n d r i a lu I l C o u p l i n gp r o t e i np l a y c di m p o r t 孤tr o l e i I lr e d o xs t a t em a i n t 即m l c e 4 C o m p a r e dw i mm o c ka n dT R v 恤a 咖e n t ，如狄Pg e l l es i l 髓c i n gi n d u c e do f H 2 0 2a n d0 2 a c c l 瑚u l a t i o no nl e a V 鼯M e a l l w l l i l e ，R O Sa c c l l m u l a t i o n 硫勰勰e d s i 嘶f i c a n t l yu n d e rP Qa n dh e a ts 仃镪s 们加e n t s ，i I lw I l i c hH 2 0 2 锄d0 2 i n c r e 豁e 4 4 6 7 觚d2 3 加P Q 骶a h n 饥tr e s p e c t i V e l yc o m p a r e d 、i lM o c k P Q 仃e a 衄锄t c a u s e ds e v e r eo x i d a t i V es 仃e s s ，F v 佰md e c r e a s e ds i 嘶f i c 锄t l ya I l dM D Ac o n t 锄t V 浙江大学硕士学位论文 英文摘要 i I l c r e a s e d P Q 仃e a t I I l e n ti n d u c e d 觚t i o x i d a n tg 黜ss u c h 船鲋刀，翻砣，舳D ， c 4 蹦G R ，P ，b u t 缸l ee X p r e s s i o nl e v e l so fT R 、U P 驮1 P + P Qw e r es t i nb e l o w M o C k + P Q 锄dT R V + P Q 仃e a 眈吼t C o m p a 似l 、i mM o c k ，P Q 仃e a t n l c n tp 1 踟t s i I l l p r 0 V e dA s A ，G S Hc o n t e n t 嬲s o c i a t e dw i mA s A D H A ，G S H + G S S Gi I 埘e 私e d H o w e w 冯m eA s Ac o n t 锄ta n dG S Hc o n t a l to fT R V 己P U C P + P Q 仃洳锄tl e a v e s w e r el o w e r 廿l 锄M o c k + P Q 觚d 圮n W + P Q 住瑚n 玎e n t n e r e 南r e ，i tw 鹤f i l 】胁盯 嘶d 锄c en l a tk 伙1 Pg 饥el 砌锄i n 】岬r t a n tr o l ei np r o m o t i n gs h 伪sr e S i s t a n c e 觚d r e d o xs i 印a l i I 坞b a l a r l C eu l l d 贫o x i d a 竹v es 仃e s s K e y sw o r d s ：t o m a t 0 ，m l c o u p l i n gp r o t e 咄p _ h o t o S y n t h c s i s ，r c s p 妇i o n ，s 臼旧s sr 豁p o 璐e ， R e d o xs i 印a 1 ，础痂v eo x y g 锄s p 喇伪 浙江大学硕士学位论文缩略词表 a c t i n A l tf e s p i r a t i o n A O X A P X A s A A 赋 c A P X C A T C i C N r e s i s t e n tR C O X C ”r e s p i 瑚【t i o n D A B E T R F B P 嬲e F v F m F W G R G s G S H G S S G H P L C 如( P C O ) 沈( P C R ) 沈( P S I I ) J m a X M D A N P Q 0 2 - P D S P n 缩略词表 A 咖 T h ea l t a m i 娃i V er e S p i r a t i o n A l t e m a t i v eo x i d 弱e A s c 0 小a t ep e f o x i d 嬲e A s c o f b i ca c i d L i g h ts a n 眦e dC 0 2 嬲s i l I l i l a t i o nm t e C y t o s o l 嬲c o b a t ep e r o 】【i d 鹤e C a t a l a s e I n e l l u l 盯C 0 2 鲫愀撇嘶 l ! N - 陀s i s i t a n tr e s p i r a ! t i C y t o c h r o m e C o 对l a s e T h ec y t 0 C h r o m er e s p i r a 矗 3 ，3 d i a m i I l o b e l l z i d i I l e E l e c 呐n 仃a I l s p o r t 豫t e F r u c t o s e - 1 ，6 - b i s p h o s 讪眦鹊e M a ) 【i I m 珊q u a n t 咖姐e l do fP S I I F r e s h w e i 出 G l u t a m i o n en 才u c t a s e S t ( m 删c o n d u c t 卸c e R e d u C e dg l u t a l i o n e O x i d i z e dg l u t a 吐l i o n e H i g l lp e 而n n 觚c e1 i q u i d E l e 讹n l l 】【细p h o t o r e s p 衲t o 巧 E l e c 仃o nn l l 】【f o rp h o t o s y n t l l e t i c T o t a le le c _ 昀nn u 】【i l lP S I I M a ) 【j m l l I I lr e g e l l e r a t i o nr a t eo fR 1 l B P M a l o n d i a l d e h y d e N o n - p h o t o c h “c a lq u e n 出r 培 D i s m 讹m o no fs u p e r o x i d e P h ”o e n ed e s a t l l r 嬲 N e tp h o t o s y T l m e t i cr a t e V 肌动蛋白 交替呼吸 交替氧化酶 抗坏血酸过氧化物酶 抗坏血酸 C 0 2 光饱和同化速率 胞液抗坏血酸过氧化物酶 过氧化氢酶 胞问C 0 2 浓度 抗K | C N 呼吸 细胞色素氧化酶 细胞色素主路呼吸 3 ，3 二氨基联苯胺 电子传递速率 l ，6 二磷酸果糖激酶 光系统I I 最大光化学效率 鲜物重 谷胱甘肽还原酶 气孔导度 还原型谷胱甘肽 氧化型谷胱甘肽 高效液相色谱 光呼吸碳氧化的电子流量 光合碳还原的电子流量 光系统总电子流量 R u B P 再生最大速率 丙二醛 非光化学猝灭 超氧化物阴离子 八氢番茄红素去饱和酶 净光合速率 浙江大学硕士学位论文 缩略词表 - l _ _ _ _ - _ - _ _ - - _ _ _ - - _ - - I _ _ l _ - _ _ - - _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ - _ _ _ - _ _ _ _ _ I - - _ _ - - - l l - l _ l - - - _ - l - - - _ - _ _ - _ _ - l _ _ l - - _ _ - _ _ l - _ _ _ - _ - _ _ - - _ - 一 P O DP e r o x i d a s e 过氧化物酶 P Q P S Q - p 0 0 l q P q R T - P C R R O S R u b i s c 0 S H A M r e s i s t e n tR S O D 侧 U C P U Q U Q H 2 G S P 酬 P h o t 0 咖I I U b i q u i n o n ep o o l P h o t o c h e I I l i c a lq u 铋c h i n gc o e 佑c i e n t C ! u 2 m t i t a t i v er e a l t i m eP C R R e 觚t i v eo x y g e ns p e c i 舔 R i b l l l o s 争l ，5 - b i s p h o s p h t e c a r l b o x y l 嬲e 0 x y g e n 嬲e S H A M 懈i s t a n t 化s p i r a t i o n S u p e r o x i d ed i 鲫吣t 嬲e T b b a c c 0 硎ev i l l 娼 U 眦o u p l i l l gp r o t e i n T h e o X i d 沱c d 向n n s o f T I l er e d u c e df 0 1 m so f u b i q l l i n 0 n 珞- j n d u c e dg e I l es i l 饥c i n g V l I I 再革枯 光系统I I 泛醌库 光化学猝灭系数 实时荧光定量P c R 活性氧 1 ，5 二磷酸核酮糖羧化加氧酶 抗S 删呼吸 超氧化物歧化酶 烟草脆裂病毒 解偶联蛋白 氧化态泛醌 还原态泛醌 病毒诱导的基因沉默 浙江大学硕士学位论文 目录 目录 致谢I 摘要I I A b s 仃a c t 缩略词表V I I 目录 l 引言 l 1 1 病毒诱导的基因沉默( V I G s ) l 1 1 1V I G s 的发现与发展。2 1 1 2V I G s 的作用机制。2 1 1 - 3 G S 在植物基因功能研究中的原理与应用3 1 1 4 影响V I G S 沉默效率的因素3 1 1 5V I G S 技术的优缺点5 1 2 植物线粒体解偶联蛋白。5 1 2 1 解偶联蛋白的发现历程。6 1 2 2 解偶联蛋白的结构、基因表达与分布6 1 2 3 解偶联蛋白的解偶联机制。7 1 2 4 线粒体活性氧的产生8 1 2 5 线粒体解偶联蛋白在增强植物抵御逆境胁迫中的作用9 1 2 6 植物解偶联蛋白与交替氧化酶的相互关系9 1 3 本文的研究目的和意义l O 2 番茄厶炉D s 与三P U C P 基因沉默( V I G s ) 体系的建立 1 1 2 1 材料与试剂。1 1 2 1 1 植物材料ll 2 1 2 菌株与质粒1 1 2 1 3 酶及试剂1 1 2 1 4 引物序列1 2 2 1 5 常用试剂配制1 2 I ) 【 j?r娜一4吁婶釉#掣5秘删7t絮”喇酬瞎柙警抓啦供4粥”日卿舻岬髂械蝴批钟肼洲m岬懈掣撼*坶嘴娜qq懈掣蚪啪w*箭诤醐嘲舶擀喃唧书科一慨瑚帮卿畔南盛；咿唰嘞南m聃梆稚搦端“卿姆猫赫赫赫岛帮拌a群邶M自 一j 。jn 一一。v 。、1 f ? v ：v 5 1 一；w 。：。、_ 下一 ”“i1 一o “= 一。“ ，1“。i： 。一 *一：L “j 7 一。：7 一 ，o 二- 。二。f ：；一| 一- ：? 一一冀：? 二? 一m 浙江大学硕士学位论文目录 2 2 实验方法1 3 2 2 1 番茄叶片总R N A 提取、纯化和c D N A 合成1 3 2 2 2 番茄工舢、艮伙c D A N 片段P c R 扩增1 3 2 2 3D N A 片段的电泳纯化回收1 4 2 2 4 回收D N A 片段与p G E M - Te 够y 载体连接1 5 2 2 5 大肠杆菌D H 5 a 感受态的制备及连接产物的转化1 5 2 2 6 序列测定及分析1 6 2 2 7 质粒D N A 提取。1 6 2 2 8 质粒酶切鉴定1 7 2 2 9 农杆菌G V 3 1 0 1 电转化感受态细胞的制备及电转化1 7 2 2 1 0 番茄幼苗G s 侵染方法1 8 2 3 结果与分析1 8 2 3 1 番茄厶尸D 跌k 矾碧基因P c R 扩增1 8 2 3 2 目的基因片段与p G E M Te 嬲y 的连接与测序鉴定1 9 2 3 3 含目的基因片段p G E M - T e 嬲y 质粒酶切回收与鉴定2 l 2 3 4 病毒载体T R V - 【e P D S 、T R V ，P U C P 构建2 l 2 3 5 番茄厶刷粥基因沉默植株表型观察。2 4 2 3 6 番茄植株厶S 基因沉默效率2 4 2 4 讨论 2 5 3 番茄线粒体解偶联蛋白基因( 如驮1 尸) 沉默植株鉴定及其对番茄光合 作用的影响 2 7 3 1 材料培养与试验设计。2 7 3 2 试验方法2 8 3 2 1 总R N A 提取、纯化和c D N A 合成2 8 3 2 2 生物量的测定2 8 3 2 3 光合气体交换与叶绿素荧光测定2 8 3 2 4R l l b i s c o 活性的测定。2 8 3 2 5F B P 鹤e 活性的测定2 9 3 2 6P s I I 光化学量子效率( m P S I I ) 和碳同化量子产量( m C 0 2 ) X 浙江大学硕士学位论文目录 的测定2 9 3 2 7 其它电子流的计算2 9 3 2 8 叶绿素荧光成像分析3 0 3 3 结果与分析3 0 3 3 1 番茄厶【，C P 基因沉默对番茄植株的表观、地上部与根系生物 量的影响3 0 3 3 2 病毒1 r I W 的分子检测3l 3 3 3 番茄如驮? 基因沉默植株的鉴定3 2 3 3 4 番茄如( ，凹基因沉默对光合作用光响应曲线的影响。3 2 3 3 5 番茄厶u c P 基因沉默对光合参数的影响3 3 3 3 6 番茄k M 凹基因沉默对R u b i s c 0 及F B P 撇活性的影响 3 5 3 3 7 番茄比u 凹基因沉默对叶绿素荧光参数的影响3 5 3 3 8 番茄厶功叩基因沉默对电子流分配的影响3 6 3 4 讨论 3 7 4 番茄线粒体解偶联蛋白基因( 厶矾碧) 沉默对番茄呼吸作用及抗逆性 的影响40 4 1 材料培养和试验设计4 0 4 1 1 材料培养4 1 4 1 2 试验设计4 1 4 2 试验方法4 l 4 2 1 总I 斟A 提取、纯化和c D l 、A 合成4 1 4 2 2 呼吸速率的测定4 2 4 2 3 细胞色素氧化酶活性的测定4 2 4 2 4 丙酮酸含量的测定4 3 4 2 5 泛醌库氧化还原状态的测定4 3 4 2 6 线粒体顺乌头酸酶含量的测定4 3 4 2 7 柠檬酸含量的测定4 4 4 2 8M 奶H 及N A D + 的测定4 4 4 2 9H 2 0 2 含量测定4 4 浙江大学硕士学位论文目录 4 2 1 0H 2 0 2 和0 2 7 组织化学染色4 5 4 2 1 1 叶片0 2 产生速率的检测4 5 4 2 1 2 叶绿素荧光成像分析4 5 4 2 1 3 丙二醛( M D A ) 含量的测定4 6 4 2 1 4 抗氧化酶活性的测定4 6 4 2 1 5A s A 和D H A 含量和谷胱甘肽含量的测定4 7 4 3 结果与分析4 7 4 3 1 番茄k 功叩基因沉默对呼吸作用的影响4 7 4 3 2 番茄k 驮碧基因沉默对细胞色素氧化酶及其基因表达的影 响。4 8 4 3 3 番茄如矾一P 基因沉默对交替氧化酶基因表达的影响4 9 4 3 4 番茄乜功叩基因沉默对泛醌库和丙酮酸含量的影响5 0 4 3 5 番茄& 【，C P 基因沉默对线粒体顺鸟头酸酶活性和柠檬酸含 量的影响。5 0 4 3 6 番茄如u c 尸基因沉默对N A D H 含量及其氧化还原状态的影 响51 4 3 7P Q 对番茄厶u c P 基因表达量的影响5 2 4 3 8 番茄厶功四基因介导P Q 对H 2 0 2 含量的影响5 3 4 3 9 番茄厶u c P 基因介导P Q 对0 2 。啥量的影响5