PCR法支原体检测.docx

PCR法支原体测定PROTOCOL关键词PCR、支原体修订记录姓名部门/职务签名日期（年-月-日）起草人审核人批准人生效日期（年-月-日） 有效期至（年-月-日） 分发部门：质量部1.目的规范PCR法支原体检测的操作方法。2.范围适用于项目研发过程样品、原液、成品及中间体的分析。3.责任质量分析人员熟悉并遵守该标准操作规程。4.定义N/A5.设备、材料和试剂5.1设备、材料设备名生产商型号/货号备注PCR仪ThermoARKTIK5020N/AVORTEXIKAGENIUS 3N/A小型台式冷冻离心机ThermoHERAEUS Fresco 21N/A单道移液器(10ul,20ul,100ul)EppendorfResearch plusN/A多功能水平电泳槽TanonHE-120N/A凝胶成像系统BIORADChemiDoc XRS+ SystemN/A5.2试剂试剂名称生产商货号TaKaRa PCR Mycoplasma Detection SetTaKaRa6601TaKaRa Ex TaqTaKaRaRR001ARegular Agarose G-10BiowestN/AGoldview国产N/A10Loading BufferTaKaRa9157DL5000 DNA MarkerTaKaRa3428A内毒素检查用水厦门鲎试剂实验厂有限公司6.溶液配制6.1 50 TAE Buffer称取242.0g Tris，37.2g Na2EDTA2H2O于1L烧杯中，向烧杯中加入约800ml超纯水，充分混匀，加入57.1ml冰乙酸，充分溶解，加入超纯水定容至1L，室温保存。有效期6个月。6.2 1 TAE Buffer量取10ml 50 TAE Buffer，加入490ml超纯水，充分混匀。有效期6个月。7.操作步骤 用于检测支原体的样品是接种后进行3-6天细胞培养的培养上清液。如果使用常用的细胞培养基时，培养上清可直接加入到PCR反应液中，如果使用细胞悬浊液作为样品，则需要提取DNA，再进行PCR反应。如果样品中含有PCR反应阻碍物，需要对DNA进行抽提，再添加到PCR反应液中，为了确认样品中是否含有反应阻碍物，在样品中加入Control Template进行正对照反应。7.1 1st PCR反应7.1.1按下表顺序配制反应混合液（50ul体系）试剂用量（ul）内毒素检查用水37.7538.7510 PCR Buffer5dNTP Mixture4MCGp F1 Primer0.5MCGp R1 Primer0.5TaKaRa Taq0.257.1.2向以上反应混合液中分别加入1ul阴性对照样品（内毒素检查用水），1ul供试品，1ul阳性对照样品(Control Template)和2ul供试品阳性对照（1ul供试品+1ulControl Template)，添加样品时务必防止交叉污染。为了避免交叉污染，实验过程需分区域操作。在实验区域1完成PCR反应液配置后，先在该实验区域加入1ul内毒素检查用水（阴性对照），再在实验区域2加入1ul供试品，最后在实验区域3加入1ul Control Template（阳性对照）及“1ul供试品+1ul control Template”（供试品阳性对照）。7.1.3将反应管置于PCR仪中，设定以下反应条件进行PCR反应。9430sec94 30sec55 2min 35 cycles72 1min72 5min7.2 2nd PCR反应7.2.1按下表顺序配制反应混合液试剂用量(ul)内毒素检查用水39.2510 PCR Buffer5dNTP Mixture4MCGp F2 Primer0.5MCGp R2 Primer0.5TaKaRa Taq0.257.2.2用内毒素检查用水将1st PCR反应产物稀释100倍，取0.5ul加入以上反应混合液中。为了防止交叉污染，加样时需分区域操作，具体加样方式同7.1.2。7.2.3 将反应管置于PCR仪中，设定以下反应条件进行PCR反应。9430sec94 30sec55 2min 30 cycles72 1min72 5min7.3 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析7.3.1 1%琼脂糖凝胶的制备称取0.4g Regular Agarose G-10，加入约40ml 1 TAE Buffer（大于40ml），置于微波炉中中高火加热2min，摇匀，再加热2min。稍微冷却后加入1ul Goldview，振荡摇匀，倒入胶槽中，冷却30min左右直至凝固。取出制备完成的琼脂糖凝胶置于多功能水平电泳槽中，加入1 TAE Buffer直至超过凝胶2mm左右。7.3.2 上样取1st和2nd PCR产物各10ul，加入1.1ul 10Loading Buffer，混匀后，取10ul上样，用6ul DL5000 DNA Marker作为对照。7.3.3 电泳及分析调节电压120V，电泳1h。取出凝胶置于凝胶成像系统，拍照并分析确认扩增片段的有无及片段大小。8.数据分析8.1 Control实验（阴性对照，阳性对照，供试品阳性对照）本实验中以内毒素检查用水作为阴性对照样品；以Control Template作为阳性对照样品；以“供试品+Control Template”作为供试品阳性对照样品。使用Control Template时，F1和R1引物扩增产物是810 bp（见图1，泳道5、6），F2和R2引物扩增产物是590 bp（见图1，泳道11、12）。当阴性对照结果呈阴性，阳性对照结果呈阳性，此反应系统可行。当供试品阳性对照结果呈阳性，说明待测样品对PCR反应无阻碍；如果供试品阳性对照结果呈阴性，说明检测样品中有阻碍物，建议将检测样品进行DNA提取，再以其作为模板进行扩增。1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 图1 1、DL5000 Marker；2、H2O-1(1st)；3、H2O-2 (1st)；4、待测样品；5、待测样品+control(1st)；6、control(1st)；7、H2O-3 (1st)；8、H2O-1(2nd)；9、H2O-2 (2nd)；10、待测样品(2nd)；11、待测样品+control(2nd)；12、control(2nd)；13、H2O-3 (2nd)8.2 供试品检测若待测样品检测结呈阴性，说明无支原体污染，若待测样品有条带，则进一步确认片段大小。表1是以12种Mycoplasma DNA分别作为模板，2对引物进行扩增所得到的片段大小。图2是12种Mycoplasma DNA，取1ng进行两轮PCR反应（反应体积为100ul）后的电泳结果。表1 12种Mycoplasma属的扩增片段大小图2 12种Mycoplasma DNA PCR反应后电泳结果8.3 问题分析8.3.1. Control Template是用于检测PCR反应性能的。当加入Control Template时，即使检测样品中含有Mycoplasma，也可能没有扩增获得与Mycoplasma相对应的片段，因此不要使用Control Template添加的反应进行样品的结果判定。为了获得准确的样品检测结果，在做PCR反应时，要保证检测样品是唯一的模板。8.3.2. 当检测样品中含有大量Mycoplasma时，有时可能只有样品中Mycoplasma的片段扩增，而正对照的Control Template片段却没有扩增。8.3.3. Control Template是人工合成的，序列中不含Mycoplasma的内部序列。8.