早实枳TFL1CEN同源基因的表达分析及功能特征-硕士论文

分类号 华中农业大学硕士学位论文 l830 80 密级 早实枳T F L l C E N 同源基因的表达分析及功能特征 E X P R E S S I O NA N A L Y S I SA N DF U N C T I o N A LC H A R A C T E R I S T I C S o F 刀呓J 删H o M o L O G o U SG E N Eo F P o N c I R U sT R IF o L I A T Am ) R a f 研究生：李红莲 指导教师：胡春根教授 指导小组：罗正荣教授 蔡礼鸿教授 邓伯勋教授 姜玲教授 专业：果树学 获得学位名称：农学硕士 研究方向：果树基因工程 获得学位时间：2 0 1 0 年6 月 华中农业大学园艺林学学院园艺植物教育部重点实验室 二O O 年六月 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 Y 1 7 9 9 7 6 1 I 谶獭嗡撼赚嘲m 喵豫m l | l l 学位论文 是否保密歪 如需保密，解密时间年 月日 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位 或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究 所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 研究生签名：巷么) 走 时间：扣f 口年6 月J 6 1 日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关予保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照 学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电 子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印，缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学 位论文的全部或部分内容，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力 注：保密学位论文( 印涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的 论文) 在解密后适用于本授权书 撇槲张私生撇名： 签名日期：函b 年i 月f 日 签名日期：2 , vo # - 多月舌日 早实枳T F L I C E N 同源某【大】的表达分析及功能特征 目录 摘 要I A B S T R A C T I I I 缩略词表V 1 前言1 1 1 问题的提出l 1 2 植物成花诱导综述2 1 2 1 成花诱导概述2 1 2 2 光周期途径3 1 2 3 春化途径7 1 2 4 自主途径9 1 2 5 赤霉素途径1 0 1 3 木本植物的童期调控1 l 1 4 本研究的内容和意义1 2 2 材料和方法1 3 2 1 实验材料13 2 1 1 供试植物材料及基因13 2 1 2 供试农杆菌菌株和质粒1 3 2 1 3 实验主要试剂和引物。1 4 2 1 4 培养基配方1 4 2 2 实验方法15 2 2 1 早实枳播种15 2 2 2 早实枳各种处理15 2 2 3 早实枳处理材料的采样1 5 2 2 4 各种处理后早实枳叶片总R N A 提取1 5 2 2 5R N A 质量检测16 2 2 6 提取R N A 的纯化16 2 2 7R N A 的反转录16 2 2 8 反转录产物的P C R 检测1 6 2 2 9 尸f 记，和P t T F L 2 的定量分析1 7 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 2 2 1 0 大肠杆菌感受态细胞的制备1 7 2 2 1 1 农杆菌感受态细胞的制备1 7 2 2 1 2 载体的构建1 7 2 2 13 质粒D N A 的提取2 2 2 2 1 4 农杆菌感受态转化一2 2 2 2 15 转化外植体材料的准备2 3 2 2 1 6 农杆菌介导的转化2 3 2 2 16 1 烟草转化实验2 3 2 2 1 6 2 转基因烟草的分子生物学检测2 4 2 2 1 6 3 转基因烟草阳性苗的移栽2 5 2 2 16 4 早实枳转化实验2 5 2 2 1 6 5 转基因早实枳苗的移栽2 6 3 结果与分析2 6 3 1P t T F L l 和P t T F L 2 的序列分析2 6 3 1 1P t T F L l 和P t T F L 2 的全序列分析2 6 3 1 2T F L l 的系统进化树2 7 3 1 3n 豫己J 和P t T F L 2 同源性分析2 7 3 1 4P t 陋已，和A 刀咒2 保守位点分析2 8 3 2P t T F L l 和P t T F L 2 的表达模式3 0 3 3A 陋己J 和P t T F L 2 的转化实验3 2 3 3 1 载体构建的P C R 及酶切检测。3 2 3 3 2 农杆菌中目的基因的检测3 2 3 3 3 T a b a c u mL i n n 的叶片对H y g B 的敏感性3 3 3 3 4 n u d i c a u l P s 的根对H y g B 的敏感性3 4 3 3 5 转基因n u d i c a u l i s 的P C R 检测3 5 3 3 6 转基因n u d i c a u l i s 的R T - P C R 检测3 6 3 3 7 转基因n u d i c a u l i s 的表型分析3 7 3 3 8 转基因t a b a c u mL i n n 的表型分析3 8 3 3 9 早实枳对H y g B 的敏感性实验3 9 3 3 1 0 早实枳的生根及微芽嫁接4 0 4 讨论4 0 早实枳T F L I C E N 同源基冈的表达分析及功能特征 4 1P t T F L l 和P t T F L 2 在进化上具有高度保守性4 0 4 2P t T F L l 和P t T F L 2 基因的表达模式4 l 4 3 烟草对H y g B 的敏感性4 1 4 4 转化P t T F L l 和P t T F L 2 两种烟草的T o 代植株表型明显4 2 4 5 实验过程中出现的问题及解决方法4 3 4 6 本研究可以开展的下一步工作4 4 参考文献4 5 致谢5 6 早实枳T F L I C E N 旧源幕冈的表达分析及功能特征 捅要 童期的发育机理一直是木本植物育种进程中备受瞩目的问题，尤其是对一些具 有重要经济价值的林木和收获果实为目的的果树来说。如何缩短童期进而提高育种 效率，一直是果树分子生物学研究的重要课题。2 0 世纪7 0 年代末在我国宜昌境内 发现的一株早花的枳壳突变体，该突变体在播种后第一年就有2 0 的开花，第三年 全部开花，并且可以在一年内多次开花。与普通枳相比，其童期大大缩短，正是因 为这个特性而被命名为早实枳( p r e c o c i o u st r i f o l i a t eo r a n g e ，P o n c i r u st r i f o l i a t a ( L ) R a f ) 。早实枳短童期阶段的特性为研究木本植物童期发育的分子机理提供了一个宝 贵的材料。 早期的果树成花研究主要集中于生理生化方面，包括环境因子及栽培技术措施 对实生苗成花的影响等，而对果树开花的分子机制及其遗传调控的研究相对较少。 本课题主要对从早实枳中分离的两个控制木本植物童期发育的关键基因( 尸f 刀咒和 P t T F L 2 ) 进行了生物信息学分析，通过实时定量研究了这两个基因在不同环境因子 影响下的响应，并通过在不同基因型的烟草中表达进行功能验证。研究主要结果如 下： 1 通过生物信息学分析发现，在尸f 刀琵J 和P t T F L 2 的全长序列内都存在4 个外 显子和3 个内含子，均编码一个1 7 3 个氨基酸读码框，预测的分子量分别为1 9 5 k D a 和1 9 2 k D a ，等电点分别为9 2 4 和8 7 9 ；并在读码框内均存在1 个P E B Pm o t i f ，而 且在两个序列内，P E B P 家族基因的两个关键位点H i s 8 8 ( 8 5 位组氨酸) 和A s p l 4 4 ( 14 0 位天冬氨酸) 都保守。在核苷酸水平上与甜橙C i T F L 分别有9 8 和7 1 的一致 性：此外，尸f 陋L J 和尸，豫阳在核苷酸序列上有7 7 一致性。 2 对早实枳通过光周期、G A 3 和不同的温度处理后，并通过实时定量检测了 n 刀吃J 和P t T F L 2 对这些环境因子的响应。结果显示：在短H 照和低温处理后，两 个基因均呈现下降的表达趋势。而当经过长日照、G A 3 和冷处理后，虽然在开花过 程中两个基因的功能相似，但是其表达水平却呈现了相反的表达模式，可能是这两 个基因在开花过程中的功能是通过不同的调控模式来实现的，从而导致了对一些因 素的响应不同。 3 烟草叶片和早实枳茎段对H y g B 的敏感性检测结果显示：它们都对H y g B 敏 感，结合本次实验结果及考虑到抗生素对外植体的伤害，初步确定N i c o t i a n at a b a c u m L i n n 叶片在转基因过程中对H y g B 的筛选压为5 m g L ，N i c o t i a n an u d i c a u l i s 叶片筛选 华中农业大学2 0 1 0 届硕上学位论文 压为2 5 m g L ，早实枳茎段筛选压为2 5 m g L ，为下一步利用H y g B 进行筛选转化植 株提供依据。 4 为了研究尸，矾J ，和尸f 刀吃2 的功能特征，分别在两种烟草：n u d i c a u l i s 和 t a b a c u mL i n n 中超表达，通过P C R 及R T - P C R 鉴定两种转化烟草发现，在 n u d i c a u l i s 的转化植株中：P t T F L l 有2 7 株呈现了阳性，阳性率为9 0 ，P t T F L 2 有3 8 株呈现了阳性，阳性率为4 7 5 ；n 矾J 和尸，阡Z 2 的T o 代植株与对照相比， 除了2 株较野生型早开花，其余均出现了不同程度的晚花，转基因植株平均比野生 型晚2 0 d 左右开花，转n 弘J 植株比转P t T F L 2 植株早开花约2 d 的时间。在 t a b a c u mL i n n 的转化株中：P f 豫己J 有5 株呈现了阳性，阳性率为8 3 3 ，P t T F L 2 有1 1 株呈现了阳性，阳性率为6 1 1 ；n 豫己和P t T F L 2 转化植株均比野生型晚开 花，而最初的差异主要表现在腋芽和节间长度方面，转化尸，刀琵J 的植株茎基部均有 大量腋芽发生，并且节间短，而转化几刀吃2 的植株则没有腋芽发生，节间较长。 5 进行了初步的几矾和A 弘阳转化早实枳的探索，均获得了8 株抗性苗， 分别选取6 株进行微芽嫁接，剩余的2 株选择直接生根。由于时间的限制，未能对 这些转化植株进行分析，但是为进一步在早实枳中研究n m 和n 刀琵2 的功能奠 定了基础。 关键词：早实枳；成花转变；载体构建；H y g B ；遗传转化。 U A B S T R A C l F o rw o o d yp l a n t s ，e s p e c i a l l yt h o s ee c o n o m i ci m p o r t a n tf o r e s ta n df r u i t t r e e s ，t h e m e c h n i s mo f j u v e n i l ed e v e l o p m e n th a sa l w a y sb e e nam a j o rc o n c e r n H o w t oe f f e c t i v e l y r e d u c et h ej u v e n i l ep h a s ea n da c c e l e r a t et h eb r e e d i n gp r o c e s s i sav e r yi m p o r t a n tp r o b l e m i nm 0 1 e c u l a rb i o l o g i c a lr e s e a r c h I n19 7 6 ，am u t a n to fP o n c i r u st r i f o l i a t a ( L ) R a fw i t ha s h o r ti u v e n i l ep h a s ew a sf o u n di nY i c h a n g ，H u b e iP r o v i n c eo fC h i n aa n d w a sn a m e da s p r e c o c i o u st r i f o l i a t eo r a n g e 2 0 o ft h es e e d l i n g sg e r m i n a t e d f r o mt h em u t a n ts e e d s n o w e r e dt h en e x ty e a ra f t e rg e r m i n a t i o n ，a n d10 0 o ft h es e e d l i n g sf l o w e r e dt h et h i r d v e a ra R e rg e r m i n a t i o n T h em u t a n tc a nf l o w e r2 - 3t i m e se v e r yy e a r C o m p a r e dw i t ht h e w i l dt y p et r i f o l i a t eo r a n g e ，t h em u t a n th a sas p o n t a n e o u ss h o r tj u v e n i l ep h a s e ，s oi t 1 s a d v a n t a g e di nb e i n g a l li d e a lm a t e r i a lf o rs t u d y i n gt h ej u v e n i l ed e v e l o p m e n t T h ep r e v i o u ss t u d i e sa b o u tt h ef l o r a lt r a n s i t i o nw e r em a i n l yf o c u s e d o np h y s i o l o g i c a l a n db i o c h e m i c a lb a s i s ，s u c ha se n v i r o n m e n t a lf a c t o r sa n dc u l t u r et e c h n i q u e s ，b u tl e s s o n t h em o l e c u l a rm e c h a n i s m sa n dg e n e t i cc o n t r 0 1 O u rs t u d ym a i n l yi n v e s t i g a t e dt h e 咖 c r i t i c a lg e n e sP t T F L la n dP t T F L 2w h i c hr e g u l a t et h ej u v e n i l ed e v e l o p m e n to f t h ew o o d y p l a I l t s W ec h a r a c t e r i z e d t h ef u n c t i o no ft h et w og e n eb yb i o i n f o r m a t i c s a n a l y s l s ， r e a l 一t i m eP C Ra f t e rv a r i o u se n v i r o n m e n t a lf a c t o r st r e a t m e n t sa n dg e n e t i ct r a n s f o r m a t i o n T h em a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： I A f t e r 锄a l y s i so ft h eg e n o m i cs e q u e n c ea n dc o n s e r v a t i v es i t e s ，、ef o u n d t h et w o 、 g e n e sP t T F L Ia n dP t T F L 2a r ec o n s i s t e do ff o u re x o n sa n d t h r e ei n t r o n s ，e n c o d m ga p u t a t i v ep r o t e i no f1 7 3a m i n oa c i d sw i t h ap r e d i c t e dm o l e c u l a rm a s so f1 9 5 k D aa n d 19 2 k D a ，a n dp Io f9 2 4a n d8 7 9 ，r e s p e c t i v e l y T h e r ea r eaP E B Pm o t i f i nt h eO p e n R e a d i n gF r a r I l eo ft h et w og e n e s ，a n dt h et w oc r i t i c a l s i t e sH i s 8 8a n dA s p l 4 4a r eV e D r c o n s e r v a t i v e T h ec o d i n gr e g i o ne x h i b i t e d9 8 a n d71 i d e n t i t yt o t h a to f 。t h es W e e t o r a I l g eC i T F L la tt h en u c l e o t i d el e v e l I na d d i t i o n ，t h ec o d i n gr e g i o n o fP t T F L le x h i b i t e d 7 7 i d e n t i t yt ot h a to fP t T F L 2 a tt h en u c l e o t i d ea n da m i n oa c i dl e v e l 2 W ei n v e s t i g a t e dt h ee x p r e s s i o no ft h e 尸f 矾J a n d 尸f m 2 i np r e c o c i o u st r i f o l i a t e o r a n g ea f t e rp h o t o p e r i o d ，G A 3 a n dt e m p e r a t u r et r e a t m e n t ，r e s p e c t i v e l y T h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h et w og e n e sh a dad o w n w a r dt r e n du n d e rs h o r t - d a ya n dl o wt e m p e r a t u r e t r e a t m e n t 。t h i si sp o s s i b l yr e l a t e dw i t ht h er e p r e s s i o no f s h o r t d a ya n dl o wt e m p e r a t u r eo n t h ev e g e t a t i v eg r o 、机h B u tt h ee x p r e s s i o no ft h et w og e n e sa p p e a r e dd i f f e r e n c e sa f t e rt h e l o n g - d a y ，G A 3a n dc o l dt r e a t m e n t ，t h e i re x p r e s s i o nw e r eo p p o s i t e ，a l t h o u g h t h ef u n c t l o n 1 1 1 兰主奎些叁堂垫! ! 星堡主兰竺堡苎 d e l a y i n gf l o w e r i n gw a ss i m i l a r I t Sp o s s i b l y t h a tt h et w og e n e si n v o l v ed i f f e r e n t r e g u l a t o r yp a t h w a ya n dr e s u l ti nd i f f e r e n tr e s p o n s et os o m e e n v i r o n m e n tf a c t o r s 3 A f t e rt h et e s ta b o u ti n f l u e n c eo fH y g Bo nt h et o b a c c ol e a v e sa n dt h es t e m so f p r e c o c i o u st r i f o l i a t eo r a n g e ，w ef o u n dt h a tn o to n l yt o b a c c ol e a v e sb u ta l s ot h es t e m so f p r e c o c i o u st r i f o l i a t eo r a n g ew e r ev e r ys e n s i t i v et oH y g B C o m b i n i n g t h et e s tr e s u l t sw i t h t h ed a m a g eo fa n t i b i o t i c so ne x p l a n t s ，w ec o n f i r m e dt h a t ：t h es e l e c t i o nc o n c e n t r a t i o no f H y g Bo nN i c o t i a n at a b a c u mL i n n 1 e a v e sw a s5 m g L ，N i c o t i a n an u d i c a u l i sl e a v e sa n d t h e s t e m so fp r e c o c i o u st r i f o l i a t eo r a n g ew e r e2 5 m g L T h i sw o u l dp r o v i d et h eb a s i sf o r s e l e c t i o no ft r a n s g e n i cp l a n t sb yH y g r o m y c i nB 4 。W eo v e r e x p r e s s e dt h et w og e n e sP t T F L la n dP t T F L 2i nt w ok i n d so ft o b a c c o s ，a n d w ed e r i v e d2 7a n d3 8p o s i t i v ep l a n t si nN n u d i c a u l i so f3 5 ：P t T F L la n d3 5 ：P t T F L 2 a n d t h ep o s i t i v er a t ew e r e9 0 a n d4 7 5 r e s p e c t i v e l y T h et r a n s g e n i cT o g e n e r a t i o np l a n t s p r e s e n t e dd i f f e r e n td e g r e e so fl a t ef l o w e r i n ge x c e p t2t a n s f o r m a n t s ，a n df l o w e r e d2 0 d l a t e rt h a nt h ew i l d t y p et o b a c c o a n dP t T F Ll t r a n s f o r m a n t sf l o w e r e d2 de a r l i e rt h a n P t T F L 2o na v e r a g e W eo b m i n e d5a n d11p o s i t i v ep l a n t si n t a b a c u mL i n n o f 3 5 ：P t T F L la n d3 5 ：P t T F L 2 a n dt h ep o s i t i v er a t ew e r e8 3 3 a n d6 1 1 ，r e s p e c t i v e l y T h et r a n s g e n i c T o g e n e r a t i o np l a n t s a l s os h o w e dl a t e - f l o w e r i n gp h e n o t y p e sw h e n c o m p a r e dw i t hw i l dt y p ep l a n t s ，a n df i r s t l y t h ep h e n o t y p i cd i f f e r e n c eW a sm a i n l yi n a x i l l a r yb u d sa n di n t e m o d e sl e n g t h T h e P t T F Llt r a n s f o r m a n t sh a dal a r g en u m b e ro f a x i l l a r yb u d s a n dt h ei n t e m o d e sw e r ev e r ys h o r t ；B u tt h e 尸，陋己2t r a n s f o r m a n t sh a dn o a x i l l a r yb u d a n dt h et n t e m o d e sw e r el o n g e rt h a nP t T F L lt r a n s f o r m a n t sa n dw i l d t y p e p l a n t s T h i sm i g h ti m p l y t h a tP t T F L lg e n ei s m a i n l yc o r r e l a t e dw i t ht h ev e g e t a t i v e d e v e l o p m e n t 5 W em a d ep r e l i m i n a r ye x p l o r a t i o na b o u tt r a n s f o r m a t i o no fp r e c o c i o u st r i f o l i a t e o r a n g e ， a n do b t a i n e d e i g h t r e s i s t a n t p l a n t s f o r3 5 S ：P t T F L la n d3 5 S ：P t T F L 2 ， r e s p e c t i v e l y W es e l e c t e ds i xr e s i s t a n tp l a n t sf o rm i c r og r a f t i n g ，a n dt w of o rr o o t i n g D u e t ot i m ec o n s t r a i n t s ，w ec o u l d n ta n a l y z et h et r a n s f o r m a n t s ，b u ta l lo ft h e s ep r o v i d eb a s e f o rt h el a t e rr e s e a r c ha b o u tt h ef u n c t i o no ft h eP t T F L la n d 几刀琵2i np r e c o c i o u st r i f o l i a t e o r a n g e K e yw o r d s ：P r e c o c i o u st r i f o l i a t eo r a n g e ；f l o r a lt r a n s i t i o n ；v e c t o rc o n s t r u c t i o n ； H y g B ；g e n e t i ct r a n s f o r m a t i o n I V 早实枳T F L l C E N 同源牿冈的表达分析及功能特征 缩略词表 A B B R E V I A T I O N 英文缩写英文名称 中文名称 V 早实枳T F L l C E N 同源幕因的表达分析及功能特征 1 前言 1 1 问题的提出 高等植物的发育包括两个明显的阶段：童期和成年期。对于所有的开花植物来 说，童期最大的特征就是即使是在成花诱导因子诱导的情况下，也不能起始花的发 育( H a c k e t t1 9 8 5 ；P o e t h i g1 9 9 0 ) ，只有经过一段时间的营养生长后，才逐渐对光照、 温度、激素和水分营养等环境因素产生响应，当这些环境适宜的情况下才进入生殖 生长阶段( P i l l i t t e r i ，e ta 1 2 0 0 4 ) 。花发育过程包括成花诱导( F l o r a li n d u c t i o n ) 、成花 起始( F l o r a li n i t i a t i o n ) 和成花决定( F l o r a ld e t e r m i n a t i o n ) 三个过程，其中成花起始 标志着植物成花转变的开始，是花的发端和花器官形成的基础，直接决定着植物的 开花时间( L e e ，e ta 1 2 0 0 8 ；P u R e d l l ，e ta 1 2 0 0 4 ) 。柑橘的童期阶段依品种不同持续5 到1 3 年不等，一些林木经济作物的童期则更长，长达2 0 年到3 0 年( M e i l a n1 9 9 7 ) ， 过长的童期对植物传统育种和转基因育种是一个很大的障碍。 目前，多个开花相关基因如刀( F L O W E R I N GL O C U S 乃、F L C ( F L O E R I N G L O C U SC ) 、”琵J ( T E R M I N A LF L O W E RJ ) 、C E N ( C E N T R O R A D l A L I S ) 、C 0 ( C O N S T A N S ) 等已经从草本模式植物中获得了分离，大量的研究表明这些基因在调 控植物茎尖分生组织的分化和成花调控途径是高度保守的( K o b a y a s h i ，e ta 1 1 9 9 9 ； K o b a y a s h ia n dW e i g e l2 0 0 7 ；M c S t e e n a n dL e y s e r2 0 0 5 ) 。植物矾J 家族是一类在进化 上高度保守的基因家族，其编码的蛋白质结构与广泛存在于哺乳动物、细菌和酵母 中的磷脂酰乙醇胺结合蛋白( P E B P ) 存在相似的结构，均具有保守的磷脂酰乙醇胺 结合域，为R a f t 激活酶抑制剂蛋白- R K I P ( M i m i d a , e ta 1 2 0 0 9 ；S h a n n o n a n d M e e k s W a g n e r1 9 9 1 ) ，特异调控R a f - 1 M E K E R K 途径( Y e u n g ，e ta 1 1 9 9 9 ) ，这种动 物蛋白起初因为在体外结合磷脂而得名( L e e ，e ta 1 1 9 9 5 ；S c h o e n t g e na n dJ o l l e s 1 9 9 5 ) 。植物种类不同，刀咒J 同源基因显示相似但不同的功能。拟南芥的刀琵属于 花序分生组织基因，对花序分生组织类型的维持起着极其重要的作用。在拟南芥中 超表达刀吃，营养期明显延长，形成多分枝的花序( R a t c l i f f e ，e ta 1 1 9 9 8 ) 。拟南芥 中所J 突变体开花早，花序分生组织转变成末端花( B r a d l e y , e ta 1 1 9 9 6 ；B r a d l e y , e t a 1 1 9 9 7 ；S h a n n o na n dM e e k s W a g n e r1 9 9 1 ) 。在木本植物中，杨树胛的同源基因尸f 刀 在自身中超表达促进开花，然而这与刀功能相反的( K o b a y a s h i ，e ta 1 1 9 9 9 ) ，这说 明P E B P 家族基因是通过一些关键的氨基酸位点来行使不同功能的。 华中农业大学2 0 1 0 届硕士学位论文 目前已经从很多植物上如拟南芥、西红柿、水稻、葡萄、苹果、柑橘和杨树等 中克隆到T F L J 的同源基因( A h n ，e ta 1 2 0 0 6 ；B o s s ，e ta 1 2 0 0 6 ；K o t o d a ，e ta 1 2 0 0 2 ； M o h a m e d ，e ta 1 2 010 ；N a k a g a w a , e ta 1 2 0 0 2 ；P i l l i t t e r i ，e ta 1 2 0 0 4 ；P n u e l i ，e ta 1 19 9 8 ； S h a n n o na n dM e e k s W a g n e r1 9 9 1 ) 。几种木本植物矾J 同源基因的异位表达均延迟 营养时期向生殖时期的转变，杨树刀吃J 同源基因P o p T F L l 除了调节花期和花序结 构外还调节杨树的休眠、莱荑花序的长度和花的数目。通过定量R e a l t i m eP C R 和异 位表达显示甜橙T F L l 的同源基因为控制柑橘章期的关键基因，柑橘章期与该基因 的转录积累呈现明显的正相关( N i s h i k a w a ，e ta 1 2 0 0 9 ；N i s h i k a w a ，e ta 1 2 0 0 7 ； P i l l i t t e r i ，e ta 1 2 0 0 4 ) 。目前除了刀吃以外，人们对于参与柑橘童期调控的其它基因 了解相对较少。上世纪7 0 年代术，在我国宜昌境内发现一株枳壳的突变体早实枳， 因其具有比普通枳壳更短的童期并且可以在一年内多次开花的特性，为木本植物童 期发育研究提供了极好的材料。 本实验室前期已经从早实枳变异中分离到了两个T F L l 的同源基因：P t T F L l 和 n 玑2 ，通过实时定量检测和原位杂交分析，结果表明这两个基因与早实枳的营养 生长和自剪密切相关，可能参与成花转变的调控过程。 1 2 植物成花诱导综述 1 2 1 成花诱导概述 植物完整的生命周期包括营养生长( v e g e t a t i v eg r o w t h ) 和生殖生长 ( r e p r o d u c t i v eg r o w t h ) 两个阶段，由营养生长转向生殖生长的过程称为成花诱导 ( f l o w e r i n gi n d u c t i o n ) 。植物的成花诱导是“多因子”互相作用的结果( A u s i n ，e ta 1 2 0 0 5 ；I r i s h ；L e e ，e ta 1 2 0 0 8 ；P o e t h i g19 9 0 ；P u t t e f i l l ，e ta 1 2 0 0 4 ) 。 高等植物的开花诱导过程受到自身遗传因子和外界环境因素两方面的影响，是 开花基因在时间和空间上顺序表达的结果。随着分子生物学技术的发展，越来越多 证据表明，成花诱导过程是一个极其复杂的调控网络。近年来，随着对拟南芥和水 稻等模式植物研究的深入，被鉴定的开花突变体越来越多，为开花诱导的研究提供 了很大的便利。尤其是在拟南芥开花过程中很多起关键作用的基因被克隆后，使这 个复杂的网络信号传导途径被逐步揭开。研究表明，植物开花诱导主要受四种反应 途径调控：光周期途径、自主途径、春化途径和G A 途径( Y a n o v s k ya n dK a y2 0 0 3 ；孙 昌辉，e ta 1 2 0 0 7 ) 。其中自主途径和G A 途径是植物通过感知发育阶段自身内源信号 来调控成花发育，而光周期途径和春化途径是通过感知外部环境信号调控成花发育。 2 早实枳T F L l C E N 同源基冈的表达分析及功能特征 1 2 2 光周期途径 光周期指的是植物对昼夜相对长度变化发生反应的现象。日长感知是植物所具 有的重要的生物学功能，反应了植物对环境变化的律动。短日照植物在白天变短夜 晚变长时开花，但在其它日长条件下不开花或者延迟开花，而长日照植物则在白天 变长夜间变短时开花；还有一些日中性植物对昼夜长短不敏感。目前通过对模式植 物拟南芥、水稻、观赏植物矮牵牛和金鱼草等的研究已了解到光周期信号被植物成 熟叶片接受和感知并产生开花信号物质，这种开花信号物质经过叶片到茎尖的长距 离运输，最终引起茎顶端成花起始( 田素波等2 0 L O ) 。 1 2 2 1 光周期信号的接受和感应 植物成熟叶片中具有能够接受并识别光信号的光受体( p h o t o r e c e p t o r s ) 。迄今为 止植物中已知的光受体主要有3 类：第1 类是光敏色素( p h y t o c h r o m e s ) ，在拟南芥 中发现至少存在5 种色素蛋白P H Y A 、P H Y B 、P H Y C 、P H Y D 和P H Y E ，这类色素 蛋白主要吸收红光和远红光( K o b a y a s h ia n dW e i g e l2 0 0 7 ) ，红光抑制拟南芥开花，远 红光促进拟南